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1、1细菌内毒素检查方法综述【关键词】 细菌内毒素检查法；,机理；,预实验；,特殊值细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从 1980 年美国药典第 20 版收载了细菌内毒素实验以来， 英国药典 欧洲药典 日本药局方中国药典等相继收载了该方法。1995 年美国药典第 23 版已收载了 471种药品进行细菌内毒素检查，而中国药典1995 年版也收载了 12 种药品进行细菌内毒素检查1 ，2000 版更收载有 47 种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细
2、菌内毒素检查法作一综述。1 方法、机理及影响因素1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认 3 种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法2 。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白） 、酶联免疫吸附法（测残余酶） 。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。 中国药典1995 年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各 0.1 ml， （371）反应（602）min。如果被检测的溶液不
3、含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定1 。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中 Ca2+/Mg2+离子浓度和 pH 等因素的影响3 。同样， 中国药典2000 年版也只采用凝胶法。1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图 1。图 1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略）2 影响细菌内毒素检查的因素2.1 检品的干扰 pH 值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对
4、凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。2.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质，还有其他物质可以通过 G 因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性” 。22.3 影响鲎实验的因素42.3.1 混合液的 pH6.08.0 才能形成最佳凝集。2.3.2 保温温度：温度应为（371）5 。2.3.3 保温时间：（602） min5 。2.3.4 在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。2.3.5 所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。2.3.6 阳性对照存在
5、。3 特殊值的确定3.1 药品的内毒素限值（L）药品细菌内毒素检查是一种限度实验，首先必须确定供试品的细菌内毒素限值。当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，就不会引起致热原反应；相反就有可能引起热原反应1 。药品细菌内毒素限值确定的方法有 3 种。3.1.1 药典给出药典规定细菌内毒素检查的品种，在药典正文可以查到相应的 L 值。 中国药典1995 年版规定了 12 种注射剂的 L 值，2000 年版规定了 47 种注射剂的 L 值，USPXX规定了 471 种注射剂的 L 值。3.1.2 根据热原检查的兔剂量计算 L=K/M，M 规定的给药途径，药品的家兔注射剂量，以 ml/k
6、g，mg/kg，/kg 等表示；K 为规定的给药途径；临床无任何不良反应的内毒素阈值，以 Eu/kg 表示。静脉（包括 im，ip，sc，ia）：5.0 Eu/kg；放射性药品：2.5 Eu/kg；鞘内：0.2 Eu/kg。3.1.3 根据人的最大注射剂量计算 L=KW/M，M 为规定的给药途径，人的最大注射剂量同样以 ml/kg，mg/kg，/kg 等表示；W 为人的平均体重，中国成人按 60 kg 计算。3.2 药品的最大有效稀释（MVD）做药品的细菌内毒素检查时，当品种的 L值与所选用的鲎试剂灵敏度（）相等时，若经干扰实验证实无干扰，可以直接检查。但许多药品的 L 值往往大于鲎试剂的灵敏
7、度（L） ，在这种情况下，若直接检查，得到阳性结果并不能说明该药品的内毒素含量超过限值。因此，当L，需要对检品作适当的稀释，但稀释的倍数不能超过一个有效的限度，这就是“最大有效稀释” ，用 MVD 表示。其计算公式如下：MVD=L/。4 重要的实验预实验4.1 鲎试剂标示灵敏度的复核实验鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，药品的细菌内毒素检查又是关系到药品安全性的重要检查3项。因此各国的细菌内毒素检查法都规定：每批鲎试剂在用于细菌内毒素检查前都必须对该批试剂标示的灵敏度进行复核。当复核的灵敏度值 0 在标示值 的 0.52.0 范围（即 0.502.0） ，方可用于细菌内毒
8、素检查，并且要按标示值使用。4.2 检品的干扰实验4.2.1 干扰实验的目的判断某个品种在某种浓度状态下是否宜作细菌内毒素检查，就需要对其作干扰实验。要求至少对每个厂家连续生产的 35 个批号（不包括亚批）的供试品进行干扰实验，若鲎试剂的来源以及供试品的配方有变化或生产工艺改变时，须重复进行干扰实验6 。 美国药典的细菌内毒素检查法及 FDA 关于鲎试剂的准则规定，用鲎试剂方法检查任何一种药品的内毒素含量之前，至少要做 3 批成品的干扰实验，如果鲎试剂的来源或制造工艺改变，或药品的生产工艺、处方、成分改变，要重做干扰实验；如果药品的特殊组分的来源或鲎试剂的批号改变，要用阳性产品对照来复检鲎试剂
9、方法对这一产品的检查有效性。4.2.2 干扰实验的原理干扰实验在美国药典的细菌内毒素检查法中称为抑制或增强实验。其原理是比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品中进行的差异。也就是比较反应在不同介质中进行的差异无差异即无干扰，有差异即有干扰。4.2.3 干扰实验的方法干扰实验是由两部分实验组成：其一是鲎试剂与内毒素在水溶液中的反应实验，这部分与鲎试剂的灵敏度复核实验完全相同。其二是鲎试剂与内毒素在检品溶液中的反应实验，也就是在检品中加入相应量的内毒素（或者说用检品的溶液来稀释内毒素） ，用来做鲎试剂灵敏度的“复核” ，比较鲎试剂在不同介质中对内毒素的“灵敏度”是否一致。4.2.4 阳性产
10、品对照用 SMVD 复溶鲎试剂，然后加入 2 浓度的标准内毒素溶液与之反应，若反应结果为阴性，说明检品对检查有抑制作用。若反应结果为阳性，说明检品对检查无抑制作用，但并未能表示无增强作用。5 应用前景细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检，也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品
11、成品的检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义；在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法，但不能区分病原体。其它在食品卫生、环境保护、电子工业（如超纯水的检查）等领域也涉及到细菌内毒素检查的应用。4参考文献：1 黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计J.中国药学杂志,1997,32(2):72.2 王茂林.鲎试剂法检查热原的应用范围J.中国医院药学杂志,1990,10(4):41.3 高国政,颜锦.pH 值影响细菌内毒素测定的实验室研究J.中国药学杂志,1998,18(3):162.4 郭录平.浅谈影响鲎试验的因素J.中国药学杂志,1996,31(3):187.5 国家药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2000：附录 86.6 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社，1995：附录 XX.
