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1、1细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究作者：王和 罗振华 徐艳 梁菁苹【摘要】 目的 检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法 分别分离 16 株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体 DNA，PCR 扩增IS986 序列以及 rpoB、katG 和 embB 基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果 自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定 L 型可在含利福平(4g/ml)、异烟肼(0.2g/ml)、乙胺丁醇(7.5g/ml)的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定 L 型仍然保留
2、IS986 基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论 结核分枝杆菌稳定 L 型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定 L 型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。 【关键词】 结核分枝杆菌； 细胞壁； 基因； 耐药性ABSTRACT Objective To determine and analyze the genes related to drug resistance, and probe th
3、e properties of drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis. Methods The sequence of IS986 and the genes of rpoB, katG and embB were isolated respectively from the L-forms derived spontaneously and induced by rifampin, isoniazid and ethambutol respectively from 16 strains of M.tuberculosis,
4、and then the genes were determined by agarose gel electrophoresis and analyzed by direct sequencing. Results The both of L-forms derived spontaneously and induced from M.tuberculosis were grow well and be subcultured in the non-high osmotic liquid media with rifampin (4g/ml), isoniazid (0.2g/ml) and
5、 ethambutol (7.5g/ml) respectively. The sequence of IS986 and the genes of rpoB, katG and embB were held in the stable L-forms and no gene mutation was found in them. Conclusion The L-forms were formed spontaneously or induced by rifampin, isoniazid and ethambutol. The L-forms derived either spontan
6、eously or induced by the antibacterial drugs from drug susceptible strains of M.tuberculosis revealed the resistance to rifampin, isoniazid and ethambutol but no gene mutation of rpoB, katG and embB could be found in the variants. It was considered that the cell wall deficiency was an important resi
7、stant mechanism of M.tuberculosis besides the chromosomal gene mutation.KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis; Cell wall; Gene; Drug resistance2细胞壁缺陷是结核分枝杆菌最常发生的变异现象之一，被认为是结核分枝杆菌生命周期独特的一个形态时期或相1 。然而近年的研究2发现，结核分枝杆菌不仅可在人工培养基及动物体内自然发生细胞壁缺陷变异，而且也可在利福平、异烟肼和乙胺丁醇等抗结核药物的诱导下发生细胞壁缺陷变异以及在含高浓度抗结核药物的培养基内传代培养。文献3报
8、道，结核分枝杆菌耐药性的形成主要同其染色体上耐药性相关基因突变有关，尚未发现质粒等其他细菌所具有的耐药性机制。为探讨细胞壁缺陷导致结核分枝杆菌形成耐药性的基因机制，本文采用基因检测与分析的方法，对自发形成和抗结核药物诱导形成的细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因进行了检测与分析，现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 材料(1)菌株 16 株结核分枝杆菌(Mycobactium tuberculosis)分别为质控菌 1株(H37Rv，R#934，编号 93009)，中国药品生物制品检定所提供，本室编号 Mk；临床分离菌 15 株，获自贵阳市肺科医院住院肺结核患者痰标本，本室编号M1M15。
9、(2)培养基 苏通培养基，按文献4方法制备。(3)诱导剂 利福平胶囊(rifampin，RFP)，批号：国药准字 H21021905，沈阳红旗制药有限公司提供；异烟肼片(isoniazid，INH)成都锦华药业有限公司提供，批号 H51020788；乙胺丁醇片(ethambutol，EMB)批号 010101，成都锦华药业有限公司提供。(4)结核分枝杆菌基因检测试剂盒 扩增结核分枝杆菌染色体 DNA 重复保守序列 IS986，引物碱基序列为 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3，5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3，扩增产物分子量为 245bp。华美生物工程公司提供，批
10、号 20050501。(5)结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒rpoB 基因检测试剂盒 扩增序列涵盖 rpoB 基因的第 507 至 533 位密码子，rpoB 基因外套引物碱基序列为 rpoB P1：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P2：5-AGTGCGACGGGTGCACGT-CGCGGACCT-3，扩增片段 215bp；内套引物碱基序列为 rpoB P3：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P4：5-GACCTCCAGCCCGGCACG-CTCACCT-3，扩增片段 193bp，无锡市克隆遗传技术研究所提供，批号 050613。
11、katG 基因检测试剂盒 上游引物 5-AGCTCGTATGGCACCGGAAC-3，下游引物 5-TTGACCTCCCACCCGACTTG-3，扩增 katG 基因 904、1523bp(620bp)，扩增片段为 katG 基因突变热点区，包括3315、321、381、406、409、418、441、456、463 和 476 位，无锡市遗传克隆技术研究所提供，批号 050613。embB 基因检测试剂盒 embB 基因外套引物的碱基序列为 E15-CGGCCTGCATCGTCGCCGGG-3、E2 5-GATCCACAGACTGGCGTCGCTG-3，内套引物E3 5-CGGCATGCGC
12、CGGCTGATTCC-3、E4 5-TCATCAGCGCCAGCAGGTTGTAA-3；E1、E2 引物扩增 embB 基因自 77218002 共 282bp 碱基序列，E3、E4 引物扩增 embB 自 77417973 共 233bp 碱基序列，第二次扩增的片段包括 embB 的突变热点区，即第 285 位、306 位、和 330 位共 77 个密码子(233 个碱基)，扩增产物分子量为 233bp，无锡市遗传克隆研究所提供，批号分别为021211、031013、030610、040503。(6)PCR 产物纯化试剂盒 Ultra Clean PCR Clean-up Kit，美国 M
13、OBIO 公司提供。(7)PCR 测序试剂 BigDye Terminator Kit，美国 PE 公司提供。1.2 方法(1)菌种鉴定 用 BACTEC-TB460 检测系统以及结核分枝杆菌基因检测试剂盒推荐的方法，对各菌株分别进行菌种鉴定，染色体 IS986 序列 PCR 扩增与检测，RFP、INH 和 EMB 敏感性测定以及 rpoB、katG 和 embB 基因的 PCR 扩增与序列分析。(2)稳定 L 型诱导与分离 根据各菌株的药物敏感性及其耐药相关基因检测结果，选择 rpoB 基因未发生突变的 Mk、M4、M5 菌株和突变的 M13 菌株，katG基因未发生突变的 M15 菌株和突
14、变的 M5、M8 菌株以及 embB 基因未发生突变的M2、M4、M5、M6、M7、M8 菌株。按文献2方法将各菌株分别接种于不含药物的苏通培养基，将 rpoB 未突变菌株接种于含 RFP 0.1、0.2、0.4g/ml 以及突变菌株接种含 RFP 1、2、4g/ml 的苏通培养基；将 katG 未突变及突变菌株接种含 INH 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08g/ml 的苏通培养基，将 embB 基因未突变菌株接种含 EMB 1、2.5、5、7.5、10g/ml 的苏通培养基，置普通温箱内 37培养和分离 L 型。(3)稳定 L 型鉴定 按上述菌种鉴定的方法，分别提取各菌株自
15、发形成和诱导形成的 L 型的染色体 DNA，进行 IS986 序列 PCR 扩增与检测。(4)稳定 L 型药物敏感性检测 取自发形成及 RFP、INH、EMB 诱导形成的结核分枝杆菌稳定 L 型纯培养物，分别接种于含不同浓度 RFP(1、2 和 4g/ml)、INH(0.2g/ml)及 EMB(7.5g/ml)的苏通培养基内，置普通温箱内 37培养并每日在显微镜高倍镜下观察 L 型生长情况。与不含药物的对照组比较，判断 L 型的 RFP、INH、EMB 敏感性。(5)稳定 L 型耐药性相关基因检测 根据结核分枝杆菌 rpoB、katG、embB 基4因检测试剂盒推荐程序，分别提取自发形成及 R
16、FP、INH、EMB 诱导形成的稳定 L型染色体 DNA 进行 PCR 扩增和 2%琼脂糖凝胶电泳及紫外检测仪观察。rpoB、katG、embB 基因的 PCR 扩增产物分别纯化后，在自动测序仪上进行序列测定与分析。 2 结果2.1 结核分枝杆菌的药物敏感性Mk、M4、M5 对 RFP 敏感，M13 对 RFP 耐药；M5、M15 对 INH 敏感，M8 对INH 耐药；M2、M4、M5、M6、M7 和 M8 对 EMB 敏感。各菌株均可检出 IS986 序列，耐药菌株可见相关基因的突变，敏感菌株未见基因突变(Tab.1)。2.2 结核分枝杆菌稳定 L 型结核分枝杆菌各菌株在不含药物的培养基内培养 1014d 后可见 L 型形成。Mk、M4 和 M5 菌株在含 RFP 为 0.1、0.2 和 0.4g/ml 的培养基内培养 2d 后可见L 型，M13 菌株在含 RFP 为 1、2 和 4g/ml 的培养基内培养 5d 后可见 L 型，M5、M8 和
