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1、1紫草多糖的体外抗氧化活性研究作者：刘婷，陈韩飞，赵文彬，李德芳，王振华，郑秋生，陈韩英【摘要】 目的研究紫草多糖的体外抗氧化作用。方法通过OH 、DPPH、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血反应体系，检测紫草多糖的抗氧化能力。均采用比色法测定。结果紫草多糖对OH、DPPH、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血均有清除或抑制作用。结论紫草多糖在体外具有抗氧化作用。 【关键词】 紫草；多糖；抗氧化新疆紫草 Arnebia euchroma(Royle)Johns 为紫草科软紫草属植物，又名新疆软紫草，收载于中国药典 ，是我国常用的中药1 ，多为草本，以根入药，因其根皮暗紫色，故名“紫草” 。该药具
2、有凉血活血、解毒透疹之功效。已有研究表明紫草具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及镇痛、抗肿瘤及免疫调节等生理活性2 。现代医学证明，心脑血管疾病、衰老及肿瘤疾病的发生和发展与体内的活性氧自由基有密切关系，而许多抗氧化成分可以清除这些自由基，阻断由它们引发的体内脂质过氧化，能够预防上述疾病的发生发展近年来，人们发现天然药物是极有潜力的抗氧化剂资源，从中寻找新的抗氧化剂是现代医药和保健品行业的发展方向。多糖是继黄酮类、多酚类、皂苷类及鞣质类之后从天然植物中发现的又一类抗氧化活性成分3 。许多植物多糖对各种活性氧(Reactive oxygen species，ROS)具有清除作用，能减少脂质过氧化产物
3、丙二醛(MDA)的生成量，提高抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶 GSHPx 等)，表现出多种途经的抗氧化作用4，5 。 研究多糖及其衍生物的抗氧化活性，对于开发出更多更好的天然抗氧化剂，逐步取代存在一定毒性、致畸性和潜在致癌性的化学合成抗氧化剂，具有重要的现实意义6 。本实验研究紫草多糖的体外抗氧化活性。1 材料与仪器1.1 药材与试剂紫草，购自新疆阿克苏地区，干燥粉碎过筛备用；1，1 二苯基2 苦肼基自由基（Sigma 公司） ；Tris(北京拜尔迪生物公司)；2 硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司） ；焦性没食子酸（天津市富宇精细化工有限公司） ；其余试剂均为分
4、析纯。1.2 仪器多功能酶标仪（Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH） ；AR2140 型万分之一电子天平（梅特勒 托利多仪器有限公司制造） ；DL360 超声波清洗机(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)。2 方法2.1 紫草多糖的制备称取 100 g 紫草粗粉用 600 ml 的石油醚（3060）脱脂 3 次，晾干，然后加入 1 000 ml 蒸馏水提取数小时，趁热过滤，重复 3 次。2合并水提液并浓缩至原体积的 1/4，加入 3 倍量无水乙醇，静置过夜后抽滤。将沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，真空干燥，即得粗紫草多糖。2.2 多糖对OH 的清除作用7空白组：30 l 0.
5、75 mmol/L 邻二氮菲溶液中加入 60 l 0.15 mol/L 的PBS （pH=7.4 ） ，加入 30 l 的蒸馏水，充分混匀后，加入 30 l 0.75 mmol/L 的硫酸亚铁，混匀后，再加入 30 l 的 1%的 H2O2 混匀。37 的水浴中60 min 后，在 536 nm 处，测定吸光度为 A1；空白对照组：以 30 l 的蒸馏水代替 H2O2 重复上述操作，在 536 nm 处，测定吸光度为 A2；样品组：以 30 l 的样品代替 30 l 的蒸馏水重复空白组操作，在 536 nm 处，测定吸光度为A3；样品对照组：60 l 0.15 mol/L 的 PBS 中加 3
6、0 l 的样品，充分混匀后，加入 90 l 的蒸馏水，在 536 nm 处测定吸光度为 A4；空白参比组：60 l 0.15 mol/L 的 PBS 加入 120 l 的蒸馏水，在 536 nm 处测定吸光度为 A5。清除率（%）=（A3A4A1+A5 ）/（A2 A1） 100%2.3 多糖对 DPPH的清除作用8向 100 l DPPH乙醇溶液（浓度为 0.2 mmol/L）中加入 100 l 紫草多糖溶液。涡旋振荡器混匀，室温，避光放置 30 min 后，在 517 nm 处测定吸光度，平行测定 3 次，并以相同浓度的维生素 C 作为阳性对照，计算清除率。清除率（%）=A0 （A1A2
7、） /A0100%式中：A0 为 DPPH溶液 100 l +无水乙醇 100 l 的吸光度；A1 为 DPPH溶液 100 l +样品溶液 100 l 的吸光度；A2 为样品溶液 100 l +无水乙醇 100 l 的吸光度。2.4 多糖对超氧阴离子的清除作用9取浓度为 0.05 mol/L 的 TrisHCl （pH=8.2）缓冲液 100 l，25 预热20 min，加入 50 l 不同浓度的紫草多糖溶液，立即加入 40 l 的 3 mmol/L的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min 后，用 10 l 的 3 mol/L 的 HCl 终止反应，在 325 nm 处测定吸光度（A1） ，
8、平行测定 3 次，并以相同浓度的维生素 C作为阳性对照。模型对照组（A0）用 50 l 的蒸馏水代替样品液。空白对照组（A2）用 40 l 的蒸馏水代替邻苯三酚。抑制率（%）=（A0A1+ A2）/A0100%2.5 多糖对卵黄脂质过氧化的抑制作用10卵黄悬液的配制：新鲜鸡蛋去卵清，卵黄用等体积的 pH=7.4 的 0.1 mol/L PBS 配成 11 悬液，并用磁力搅拌器搅拌 10 min（置于冰箱中 4）备用，使用前用 PBS 稀释成 125 的悬液。吸取 125 的卵黄悬液 20 ml，加入 20 ml 的不用浓度的紫草多糖溶液，再加入 20 ml 的 25 mmol/L 的 FeSO
9、4，用pH=7.4，0.1 mmol/L 的 PBS 补至 200 ml，37振荡 15 min，取出后再加入 50 3l 的 20%的三氯乙酸，4 000 r/min 离心 8 min，吸取 100 ml 上清液加入 50 ml 0.8%TBA，封口，沸水浴中煮 15 min，在 532 nm 处测吸光度，平行测定 3 次，并以相同浓度的维生素 C 作为阳性对照。以不加样品管的吸光度为 A0，以样品加 PBS 管的吸光度为 A 样。抑制率（%）=（A0A+A 样）/A0100%2.6 多糖对红细胞溶血的抑制作用11小鼠摘眼球取血，加入肝素制成抗凝血，以 4 000 r/min 离心 5 mi
10、n，再用预冷的生理盐水洗 3 次，制成 0.5%的红细胞悬浮液。取红细胞悬浮液 200 ml，加入样品溶液 40 ml，最后加入 0.1 mol/L 的 H2O2 20 ml，混匀，于 37水浴中温浴 60 min，然后 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用生理盐水稀释 5倍，于 415 nm 处测定吸光度（以红细胞在超纯水中的溶血率为 100%计算） 。抑制率（%）=（A0A 样）/（A0-A）100%式中：A0，H2O2 诱导对照组吸光度；A 样，样品组吸光度；A，正常组吸光度。2.7 统计分析每次试验均设 4 个平行管，取平均值为 1 次试验数据，试验重复 3 次，采
11、用SPSS 10.0 软件处理，所有数据均用s 表示。3 结果3.1 紫草多糖清除羟自由基的能力结果见图 1。Fenton 反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2 的量和 Fenton 反应产生的OH 的量成正比，当给予电子受体后，用 gress 试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH 的量成正比关系。由图 1 可见，紫草多糖在实验浓度范围内对羟自由基的清除作用呈现出良好的量效关系，并且浓度越大，紫草多糖的清除羟自由基的能力越接近维生素 C。3.2 紫草多糖清除 DPPH的能力结果见图 2。人工合成的 DPPH 是少数化学性质稳定的自由基之一，其乙醇溶液呈深紫色，在 517 nm 附近有
12、强吸收峰。当 DPPH溶液中加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用比色法进行定量分析，评价样品的抗氧化能力12 。从图 2 可以看出，紫草多糖具有较强的清除 DPPH 自由基的能力，且随着样品溶液浓度的增加，清除率逐渐增高，呈剂量依赖关系。3.3 紫草多糖清除超氧阴离子的能力结果见图 3。4在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成 O2和有色中间产物，该有色物质在 325 nm 处有一特征吸收峰。当加入清除剂时， O2的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在 325 nm 处的吸光度减小。故通过测定 A325 值可以定
13、量计算出清除剂的清除率13 。实验结果（图 3）表明，紫草多糖、维生素 C 对超氧阴离子的生成均有清除作用，且随着浓度的增加作用增强。在较低浓度时，紫草多糖对超氧阴离子的清除作用强于维生素 C。3.4 紫草多糖对卵黄脂质过氧化的抑制作用结果见图 4。卵黄中磷脂 C2 位上所含极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）中的不饱和脂肪酸（PUFA）在亚铁离子的催化下，能诱发过氧化，产生烷氧基（RO）和烷过氧基（ROO） ，从而引发链式反应。且在加热的条件下，其产生的过氧化物可与硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红色化合物，并在 532 nm处有最大吸收14 。由图 4 可知，紫草多糖、维生素
14、C 对卵黄脂质过氧化的抑制作用呈剂量依赖性，且在相同浓度下，紫草多糖对脂质过氧化的抑制作用接近维生素 C。3.5 紫草多糖对红细胞溶血的抑制作用结果见图 5。过氧化氢在体外诱导红细胞氧化而发生溶血，致使红细胞膜流动性降低，膜脆性增加，改变细胞膜的完整性，导致红细胞损伤，胞内物质外流。结果表明，紫草多糖、维生素 C 均能降低 H2O2 诱导的红细胞氧化溶血率，溶血抑制率随着样品浓度的增大而增加，当浓度低于 12.5 mg/L 时，紫草多糖与维生素 C 抑制溶血的能力相当。4 讨论O2、OH 及 H2O2 是生物体内主要的活性氧自由基，由它们引发的体内脂质过氧化是机体衰老、动脉硬化、心血管病及肿瘤
15、发生的重要原因，而使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应, 可以抑制机体的自由基损伤，从而保持最佳健康状态和防治相关疾病， 延缓衰老15 。目前国内外也已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健食品的开发也具有积极作用16 。我们的研究表明，紫草多糖具有较强的清除羟自由基、DPPH及超氧阴离子和抑制卵黄脂质过氧化的作用，且呈剂量依赖性，其可能的作用机理如下：紫草多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于OH 而言，可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而紫草多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧自
16、由基，最后分解成对机体无害的产物；对于5O2，紫草多糖可与其发生氧化反应，最终达到清除的目的17 。目前，对紫草多糖抗氧化的研究不够深入，抗氧化作用与多糖结构的关系仍不明确。此外，紫草多糖用于药理学实验的是一些粗制品，这使得要在分子水平上阐明其药理作用和作用机制受到了很大限制，有待于我们的进一步深入开展多糖的纯化以及抗氧化作用与其构效关系的研究。【参考文献】1国家药典委员会. 中国药典S. 北京：化学工业出版社，2005：238.2周延萌，高允生. 中药紫草的药理作用与临床应用J.医药导报，2008，27(7)：786.3刘树兴，赵芳.从天然植物中开发抗氧化剂的研究进展J. 食品研究与开发，2007，28 (7)：179.4徐晓云，潘思轶，谢笔钧，等. 沙
