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1、1消除胆红素对肌酐测定的负干扰 摘要 胆红素对碱性苦味酸速率法检测肌酐的负干扰。一直是临床化学技术中学的一个棘手的问题，对临床高胆红素血症病人的肾功能观察带来很大影响。多年来，国内外不少作者报道了排除这一干扰的方法，但多是从样品预处理或试剂中加入抗干扰成分（如高铁氰化钾、胆红素氧化酶、过氧化氢过氧化物酶）入手，最近国内外有人报道利用酶法和某些全自动生化分析仪的特殊功能 Rate-Blank 或 Rate-B 法能够从方法学角度排除干扰，并取得了良好的效果。本文就这一问题进行回顾和评价，并对各方法进行比较。 关键词：肌酐；Jaffe 法；速率法；胆红素 测定血清肌酐（简称 CRT）的 Jaffe
2、 氏法已经沿用了 100 多年，至今仍然被广泛地应用，然而对肌酐的显色并不特异。血清中能与碱性苦味酸反应的物质还有蛋白质、葡萄糖、抗坏血酸、丙酮、-酮酸等。这些“假肌酐”物质通常对肌酐测定产生正干扰。由于它们的反应速度比肌酐慢，因此利用速率法在20100s 间进行测定1可以使肌酐的反应占绝对优势，提高反应的特异性。尽管如此，仍旧不能克服胆红素对测定的负干扰。如何消除这一干扰，近年来，已经有许多报告。本文就这一问题进行回顾和评价。 1 胆红素对肌酐测定产生负干扰的原理 碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成了一种红色复合物，通常在 510nm 外根据测定时间（2080s）内血清和标
3、准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在 510nm 处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为 620nm 处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在 520nm 处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值。有实验证明1，氢氧化钠对胆红素的作用与肌酐存在与否无关；肌酐含量越低，本身的显色反应弱，相对干扰就严重。血清中的游离、结合胆红素对肌酐的动力学测定都有干扰作用。 2 预处理法 预处理法主要是利用各种氧化物，使胆红素被氧化成胆绿素后再测定血清肌酐含量。加入的氧化物主要有以下几种： 22.1 高铁氰化钾 OLeary 和 pembroke
4、等人2设置试剂 1（R1）：高铁氰化钾 2mmol/L，试剂 2（R2）：氢氧化钠 200mmol/L，若味酸 25mmol/L，临用前按5：1 配制。标本：R1：R2=20L：20L：400L。主波长 505nm，副波长570nm。样品与 R1 混合后 5min 再加入 R2，延滞时间 60s，读数时间 60s。试验证明 600mol/L 以内的胆红素对肌酐测定无影响。汪俊军等人3推荐含有十二烷基硫酸钠、硼酸、氢氧化钠、苦味酸、高铁氰化钾浓度分别为24、10、200、15.5、0.20mmol/L 的试剂配方为临床实验室自动化分析测定肌酐的试剂配方，样本与试剂体积比为 3：29，其它参数：波
5、长 520nm，温度 37，测定时间 30s，延迟时间 20s。汪氏认为当高铁氰化钾浓度达到 0.20mmol/L 时，转变 1000mol/L 的胆红素可以在前 20s 内基本完成。可以看出用高铁氰化钾可以较好地消除胆红素对肌酐测定的干扰，但范仲元等人4提出加入的高铁氰化钾的量对测定结果有一定影响。试剂中加入高铁氰化钾后，标准液的反应速率有下降趋势。血清标本反应速率在加入高铁氰化钾浓度较低时有下降，但下降比率远较标准液为小，而加入浓度较高时反应速率有明显升高，总的效果是加入高铁氰化钾后使肌酐测定结果升高，且随高铁氰化钾浓度的升高而升高。 2.2 过氧化氢过氧化物酶 叶耀征等人5取黄疸病人血清
6、 200L，加入 1.76mol/L 过氧化氢 5L 混合，再加 800KU/L 过氧化物酶 5l，充分混合后置 37水浴 15min。3000rpm 离心 3min 后再与碱性苦味酸试剂反应测定血清肌酐。试验证明 200mol/L 以内的胆红素对肌酐测定无影响。可以看出，由于在消除胆红素过程中需要一定的水浴时间和温度，此法比较繁琐，不利于全自动生化分析仪操作。为了克服以上缺点，Rajs 等人6将该法进行改良，认为由于间接胆红素与白蛋白为非共价结合，所以过氧化氢对直接胆红素的氧化过程快于对间接胆红素的氧化，为了提高氧化效率，缩短氧化时间，将咖啡因苯甲酸盐加入过氧化氢过氧化物酶中，使间接胆红素从
7、蛋白质中 置换出来，37反应 7min（多数情况下，35min 已经足够）后，再加入碱性苦味酸试剂测定血清肌酐。用该法在 Cobas mira 全自动生化分析仪上证明 435mol/L 以内的胆红素对测定无影响。尽管如此，由于过氧化氢与过氧化物酶、氢氧化钠与苦味酸需临用前配制且不宜久置，所以操作上仍比较繁琐。 2.3 胆红素氧化酶 Lorene 等人7利用胆红素氧化酶在肌酐测定前预处理血清样品取得了良好效果。其中胆红素氧化酶 1000U/L。室温孵育 15min。国内陈伟英等人8利用胆红素氧化酶在 Cobas fARA-型全自动生化分析仪上也取得了类似的效果，将样品 8L 与胆红素氧化酶（20
8、0U/ml）8L 混合，以胆红素氧化酶氧化样品中的胆红素，再加入若味酸试剂 80L 作为起动试剂，进行肌酐测定，其中保温时间 90s，反应时间 100s。但由于胆红素氧化酶不易获得且成本较昂贵，因此该法在国内未得到普及。 3 采用酶法测定肌酐 3piero fossati 等9和张厚亮等10利用该法测定血清肌酐，其中试剂1：N-哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）-NaOH 缓冲液、肌酸脒基水解酶（CRTase） 、尿素酶、谷氨酸脱氢酶（GLD） 、异柠檬酸脱氢酶（ICD） 、-酮戊二酸。试剂2：HEPES-NaOH 缓冲液、CRNase、反式 N，N，N ，N-四乙酸-1，2-二氨基环乙烷（
9、CYDTA） 。其反应原理略。 酶法测定肌酐具有操作简便、特异性好、灵敏度高、不受胆红素及多种药物影响、适用于全自动或半自动生化分析仪，不仅能测定血清，而且也可以测定尿液，是目前认为测定肌酐最好的方法，但是其价格相当昂贵，一般至少是碱性苦味酸法的 10 倍以上，就国内医疗水平，难以普及。 4 采用 Rate-Blank 或 Rate-B 法测定肌酐 rate-Blank 法是利用全自动或半自动生化分析仪中的特殊功能（样品速率空白）来达到克服胆红素干扰的目的。所谓样品速率空白是指将样品与试剂1（氢氧化钠）混合后作为样品空白测得的反应速率，也就是样品中胆红素被氢氧化钠氧化吸光度下降的反应速率，仪器
10、经过自动扣除这种反应速率，将胆红素的负干扰值自动补偿入肌酐与碱性苦味酸的反应中，从而达到了消除干扰的目的。Hoffman rJ、Gerhard g 及 Alecey v Moshkin 等人1113利用 Rate-Blank 法在 Hitachi737、736、Cobas mIRA 上取得了良好效果。N.OLeary 等人1将高铁氰化钾法与 Rate-Blank 法相比较发现两法有很好的一致性。 rate-B 法（twin test）是利用同一反应杯在一个反应周期内进行两个试验测定的功能。如果这两个试验均为速率法时，第一个反应的速率可以自动补偿入第二个反应的速率中去。我们把血清肌酐测定过程分解
11、为两个试验，第一个试验测定胆红素在碱性环境下被氧化引起吸光度减少的速率，第二个试验测定加苦味酸后，肌酐与苦味酸反应所引起吸光度增高以及胆红素被氧化所引起的吸光度减少的总的速率。即前者测定胆红素的干扰，通过仪器微机自动处理，后者在结果计算中自动清除这种干扰，从而利用 RATE-B 法达到清除胆红素对肌酐测定干扰的目的。Osselaer、Lievens 及石凌波、林龙顺等人14，15利用该法在Hitachi717、704、747、7150 分析仪上取得良好效果。 rate-Blank 或 Rate-B 法从方法学角度克服了黄疸对肌酐测定的干扰，试剂中不加任何附属成分，操作简便，与酶法结果一致，但此
12、法在应用过程中受到了仪器的局限性。 5 小结 4近年来，国内外关于胆红素对肌酐测定的负干扰已有许多报道，总的来说，以上的方法各有千秋。预处理法由于添加了其它成分，操作不可避免地显得冗长、繁琐，另一方面因为附加成分的介入，破坏了原有反应体系，可能又会引起新的干扰。但是对于缺乏 Tate-Blank 或 Rate-B 法的生化分析仪，预处理法不失是一种很好的消除干扰的方法。而酶法测定肌酐由于价格的关系，目前只被国内少数医院接受，难 以普及。我们认为各单位可以根据自己的实际情况来选择测定肌酐的方法。 参考文献 1 汪俊军，庄一义，刘海萍.临床检验杂志，1990；131-132 2 N.OLeary,
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