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1、无菌工艺验证 培养基灌封试验,主讲人： 崔强 2008年3月 E-mail: ,-2-,为什么需要 进行培养基灌封试验 ？,-3-,来自生产工艺的要求,对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方法。 无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌是该工艺最大的难点。 减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施,人员培训 无菌工艺验证,-4-,最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异,最终灭菌工艺 在高洁净净环境下进行灌装和密封 通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低 在密封容器中进行最终灭菌 无菌生产工艺 产品、容器和密封件分别进行
2、灭菌，然后进行灌封 在极高洁净环境下进行灌装和密封 产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理 对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控 在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险,空瓶,灭菌隧道,密封件,蒸汽灭菌釜,除菌过滤,人员,半压塞瓶,冻干机,全压塞瓶,-5-,来自FDA和USP的要求,FDA CGMP 无菌工艺药品指南（2004年版） An aseptic processing operation should be validated using a microbiological growth medium in place of the product. This proces
3、s simulation, also known as a media fill. USP 31 洁净室和其它控制环境的微生物学评价 To assure that minimal bioburden is achieved, additional information on the evaluation of the microbiological status of the controlled environment can be obtained by the use of media fills. An acceptable media fill shows that a succe
4、ssful simulated product run can be conducted on the manufacturing line at that point in time.,-6-,来自EU GMP和国内的要求,EU GMP 附件1 无菌药品的生产（2008年2月新版） Validation of aseptic processing should include a process simulation test using a nutrient medium (media fill). 中国药品生产质量管理规范 附录（1998年修订） SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试
5、行） 培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一种系统验证,是判断无菌保证水平的关键手段 采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证SAL不大于10-3,-7-,无菌工艺产品的无菌保证,无菌工艺产品,Personnel,Environment,工艺验证,人员,原料,环境,无菌检验,-8-,作业环节与风险,-9-,培养基灌封实验的 常规要求,-10-,定义与目的,目的 证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力 对人员进行资格确认 符合cGMP的要求,使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进行验证。又称为“工艺模拟试验”.,-11-,工艺模拟试验的通常流程,将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面
6、和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。,对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。,评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。,-12-,培养基灌封试验的时机 初始验证与再验证,初始验证 需要重复多次，以确保结果的一致性和有效性。,有差异的多次实验结果,工艺过程失控的象征,定期再验证 定期进行，评估无菌工艺的受控情况。 应综合考虑每一班次及班次变化过程中有代表性的活动及干预。 对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。,-13-,培养基灌封试验的时机 增补性培养基灌封试验,变更及其评估 对产品或生产线的每一种变更，均应根据
7、书面的变更控制系统进行评估 。 如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基灌封实验。 比如，设施或设备的变化、生产线配置的变动、人员重要变动、环境监控结果异常、容器-胶塞系统变更、停车时间延长、无菌检查结果阳性等。,-14-,实验用培养基和培养温度的选择,选择时的注意事项 适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌 较好的澄明度，较小的粘度 易于除菌过滤 常用培养基：3大豆胰蛋白肉汤（TSB） 厌氧培养基仅在特殊情况下使用 培养温度 FDA - 20-35，目标值2.5，不少于14天；如选择两个温度，则每一温度下至少培养7天，从低温开始。 PIC - 20-
8、25下至少14天，或，先20-25下7天， 然后30-35下7天。,-15-,灌装体积与数量,灌装体积 每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3 同样，灌装体积也不宜过大 既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持微生物生长。 灌封数量 综合考虑统计学要求和实际生产批量。 FDA (5000瓶)：如果正常生产的批次量低于5000瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。 PIC (3000瓶)：如果正常生产的批次量低于3000瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。,-16-,灌封时间与批次量控制,灌装时间 对于初始性验证，培养
9、基灌封实验应安排在一周内的不同时间进行。 对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行。 灌封时间要涵盖实际生产班次。 批次量控制 初次验证，至少要连续成功灌封3个批次。 再验证至少需要成功灌封1个批次。,-17-,培养基灌封实验的合格标准,FDA指南（2004版）与EU GMP 附件1标准统一 灌封量10000瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3批）。 注：欧盟标准将自2009年3月起执行。,-18-,培养基灌封实验的合格标准,2009年3月以前欧盟通用标准：污染率低于0.1% 计算公式：实际污染率 = (95%置信限值)/(灌封容器数) 100
10、%,污染瓶数与95%置信限值间的关系,-19-,培养基灌封实验的合格标准,SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）,培养基灌装试验的批量与判断合格的标准,-20-,不同剂型的特殊要求,-21-,冻干制剂对培养基灌封的要求,冻干制剂的典型生产流程 配制灌装冻干加塞轧盖,第一种方式，模拟装载/卸载过程，缩短放置时间（首选） 容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机 冻干机内部分抽真空（500mbar），在室温放置一定的时间，不得冷冻。 用无菌空气破真空（不使用惰性气体），全压塞 轧盖 注意，若所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查。,冻干制剂培养基灌封试验的特殊性 对产品在冻干机内放
11、置步骤的模拟,-22-,冻干制剂对培养基灌封的要求,第二种方式，模拟冻干时间 半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。 缺点：耗时长,第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程 容器内灌封好经稀释的培养基（diluted medium），以半压塞状态装入冻干机 模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（full strength）为止。 缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均一，影响微生物的存活力。,-23-,粉针剂对培养基灌封的要求,第一种方法 在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖或熔封。 第二种方法 先灌装干粉培养基，再加入注射用水 第三种方法 先灌装惰
12、性剂，再加入液体培养基 要点 采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需事先经过辐射灭菌。 常用惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖。,-24-,混悬剂/半固体制剂对培养基灌封的要求,悬浮剂 需要模拟搅拌或循环流动的过程。 如果有无菌添加过程，也应进行模拟。 半固体制剂 需要将液体培养基增稠到适当粘度。 可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。 在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检查其混浊度和真菌菌落，也可进行无菌检查实验。 如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要对其进行验证。,-25-,方案 与 报告,-26-,
13、制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）,生产线最长运行时间及其造成的相关风险 干预的次数、类型和复杂程度 是否有冻干工序 设备的无菌装配 总人数和所从事的操作 无菌加入和无菌转移的次数 班次更换、暂停和必要的更衣 无菌设备的拆卸与连接 环境监测,-27-,制订培养基灌封实验方案的考虑因素（二）,生产线的配置和运行速度 产品重量检查 容器/密封系统 与无菌操作相关的各种特殊规定 总人数和所从事的操作,总的原则 综合考虑生产线可能造成污染的各种因素 尽可能模拟实际生产的无菌操作 可能时，应包括最差条件的模拟测试,-28-,验证开始前的准备工作,设备确认 通风系统（HVAC）的确认 设备的在线清洗和
14、灭菌CIP,SIP 灭（除）菌工艺验证 湿热、干热灭菌工艺 除菌过滤 空气过滤器的完好性检测 容器/胶塞密封完好性测试 人员培训 洁净室环境达到设计要求,-29-,培养基灌封实验方案的内容举例,定义被模拟的工艺 定义使用的房间，灌封线和设备 使用的容器和密封件的类型 灌装线的速度 灌封数量 模拟过程中的干扰和中断的数目和类型 参与的人员数目 使用的培养基,灌封到容器内培养基的体积 选择的最差条件及其原理 培养条件，培养温度，培养时间 所进行的环境监测 批记录复印件 职责说明 所有工作的合格标准 列举最终报告中需要的文件 本次模拟的持续时间,-30-,方案的执行与记录（一）,培养基灌封的日期和时
15、间 使用的房间和设备 容器胶塞的型号和尺寸 培养基种类和灭菌方式 每容器中的灌装体积 灌装速度 灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因 培养的瓶数，阳性的数量 培养时间和温度,-31-,方案的执行与记录（二）,环境监测的数据 参与培养基灌封的人员 培养基灵敏度检查的结果 有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。 如发生异常情况，需给出调查报告。,-32-,培养基灌封实验中的环境监测,环境监测按照相应的规程进行，包括： 空气粒子数 沉降碟 浮游菌 表面监测 人员监测 对无菌生产区环境的评估,-33-,培养基灌封实验中的灵敏度检查实验,培养基灵敏度检查实验： 使用完成14天培养的灌封前期培养基样品
16、用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌 将每个菌种准备含100cfu/0.1ml的菌液，每个菌种接种2支培养基样品，同时并平板计数（双份） 对真菌在20-25C下培养，对细菌在30-35 C下培养，每天检查，5天内需有生长迹象,-34-,再验证与增补性验证的要求,再验证 对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时间为5-7个月 。 人员至少每年参加一次再验证，以进行资格再确认。 每条生产线轮流使用最大和最小规格的容器，变换生产线的速度。 增补性验证 根据风险程度决定培养基灌封实验的批数。通常为1-3批。,-35-,培养基灌封实验的总结报告,最终报告中应包括以下内容 模拟的最差条件 事件清单 环境监测结果 微生物鉴别结果 培养基的营养检查实验结果 培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶数等信息。 结论（结果是否可以接受）
