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1、1海藻提取物 Fucoidan 抗肿瘤作用的实验研究【摘要】目的研究海藻提取物 Fucoidan 抗肿瘤作用，并对其机制进行初探。方法观察 Fucoidan 对小鼠 S180 移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响。结果 Fucoidan 能明显抑制小鼠 S180 实体瘤的生长（P0.01） ，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的70.4%78.2，对体外培养 A549 细胞、HeLa 细胞和 L1210 细胞的生长均无显著抑制作用，Fucoidan 中剂量组和大剂量组能显著提高碳粒廓清实验中的廓清指数 K、吞噬指数 和脾脏器指数（P0.05 或 P0.
2、01） ，但对胸腺脏器指数影响不大。在 DNFB 诱导迟发性变态反应实验中，Fucoidan 中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大。结论 Fucoidan 具有抗肿瘤作用，其机制可能是通过对免疫功能的增强来实现的。【关键词】海藻提取物褐海藻多糖硫酸酯；抗肿瘤Abstract：ObjectiveToobservetheantitumoractionofFucoidanextractedfrombrownalgaUndariapinnatifida.MethodsThemodeofimplantedS180tumorwasestablishedinmice.Theinhibitoryeffec
3、tontumorwasobservedinmiceafterFucoidanwasgivenorally.TheinhibitoryeffectinA549,HeLaandL1210cellsbyFucoidanwiththemethodofMTTwasinvestigatedinvitro.TheimmunefunctionofFucoidantonormalmicewasdetectedthroughtheexperimentontheclearancerateofcharcoalparticlesanddelayedtypehypersensitivereaction(DTH)induc
4、edbyDNFB.ResultsFucoidanshowedsignificantinhibitiononthegrowthofS180tumorinadose-dependentmanner（P0.01）,butnosignificantanti-proliferativeeffectsonA549,HeLaandL1210cells.Theclearancerateofcharcoalparticles,spleenindexandearedemainducedbyDTHwereimprovedinhigh-doseandmiddle-dosegroups（P0.05;P0.01）.Con
5、clusionFucoidanhasantitumoraction,andthemechanismmayberelatedtostrengtheningtheimmunefunction.Keywords：FucoidanextractedfromBrownAlga;AntitumorFucoidan 是一种从日本褐藻 Undariapinnatifida 中提取的天然多糖类成分，含有 4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖（4-mono-O-sulfo-L-fucopyranose） 。现有研究证明，从多种褐藻中提取的 Fucoidan 具有多种生物效应，如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等，已在日本作为功能食
6、品、化妆品等广泛使用1 。其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。本实验以体内、体外方法，观察 Fucoidan 对小鼠 S180 移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响，以对其抗肿瘤机理进行探讨，为其临床应用提供基础。1 材料1.1 药品与试剂2Fucoidan 由武汉和利有限公司提供，为黄褐色粉末，在水溶液中溶解度好。环磷酰胺：山西普德药业有限公司生产。型胶原酶、噻唑蓝（MTT） 、放线菌素D、脂多糖（LPS）：购自 Sigma 公司；RPMI-1640 培养基、新生牛血清（NBS）：GIBCO 公司生产。1.2 动物及分组昆明种小鼠（湖北省实验动物中心提供） ，1822
7、g，雌雄各半。体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组，Fucoidan 小、中、大剂量组及阳性对照组共 5 组，每组 20 只；对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组，Fucoidan 小、中、大剂量组共 4 组，每组 10 只。Fucoidan 小、中、大剂量组分别按 1，2，3mg/10g 灌胃给药，对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和 0.3mg/10g 环磷酰胺，1 次/d。1.3 瘤株A549 细胞（人肺癌上皮细胞系） 、HeLa 细胞（人宫颈癌上皮细胞） 、L1210细胞（小鼠淋巴细胞性白血病细胞）：由武汉大学典藏中心提供；荷瘤 S180 腹水型小鼠：由华中科技大
8、学同济医学院提供。2 方法2.1 体内抗肿瘤活性的检测2模型组和 Fucoidan 各组按剂量要求预防性灌胃给药 7d。第 7 天给药后 1h，由荷瘤 S180 腹水型小鼠体内无菌抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至 2.51010/L，混匀后，每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液0.2ml。各组如前给药，连续 2 周，最后 1 次给药 24h，动物处死，并剖取各组动物皮下肿瘤，称重。与模型组比较，计算抑瘤率。2.2 体外抗肿瘤活性的检测2采用 MTT 法。10RPMI1640 生长培养基培养细胞，收集对数期细胞，用2RPMI1640 维持培养基调节细胞浓度，除空白调零孔外，每孔均匀
9、接种约2104 个细胞180l 到 96 孔板中。空白调零孔仅加入10RPMI1640180l。37、饱和蒸气、5CO2 培养箱培养过夜使其充分贴壁，37、饱和蒸气、5CO2 培养箱培养过夜使其充分贴壁，然后除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入终浓度为 510-1，110-1，510-2，110-2，510-3，110-3，510-4，110-4mg/ml 的 Fucoidan20l，每个浓度各设 4 个复孔，正常对照孔仅加入 PBS20l。因 Fucoidan 有颜色，每个浓度组均设一不加细胞，只加 20l 相应浓度培养液的对照孔。Fucoidan 继续培养 48h后，弃去孔内液体，每孔
10、加入 5mg/mlMTT20l,37、饱和蒸气、5CO2 培养箱放置 4h。每孔加入 DMSO20l,37、饱和蒸气、5CO2 培养箱放置 30min 后，3平板离心机 2000g10min 离心后，低速振荡 15min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 570nm 处测量各孔的光密度值（OD570） 。给药各组所测 OD570 需减去对照孔 OD570。2.3 对正常小鼠免疫功能的影响碳粒廓清法3：各组按分组灌胃给药 7d,1 次/d。最后一次给药后 1h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁 0.1ml/kg，注毕即刻计时。在注射墨汁后 3min 和 13min，分别以预先用肝素处理过的玻
11、璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血0.025ml，将所取血液加入含 0.1Na2CO32ml 的试管中，摇动试管使均匀混合，在分光光度计上测定 600nm 波长处每个样品的光密度值（OD600）,0.1Na2CO3液作空白对照。称重肝脾末次取血后，立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脾，去除脂肪和结缔组织，滤纸拭干后分别称重记录。并计算清除速度 K 值、吞噬指数 和脾、胸腺脏器指数：清除速度 K 值 K=LgOD1-LgOD2t2-t1吞噬指数 （每克组织重量的吞噬活性）：=体重肝重-脾重3K脾、胸腺脏器指数器官重量/体重102，4-二硝基氟苯（DNFB）诱导迟发性变态反应（DTH） 2：各组按分组灌胃给药
12、7d，1 次/d。第 7 日给药后，每鼠腹部剪毛（3cm3cm） ，均匀涂抹1%DNFB50l 致敏，继续用药后第 5 天再用 1%DNFB10l 攻击右耳，24h 后处死动物，用打孔器取下直径 8mm 耳片，称重，以左右耳重量之差（肿胀度）来表示DTH 程度。2.4 统计学处理数据均以s 表示，两组间均数比较采用 t 检验。3 结果3.1Fucoidan 对 S180 实体瘤的抑制作用肉眼观察，模型组小鼠瘤块不断增大，边界不清，不易剥离，而 Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。表 1 所示，Fucoidan 能明显抑制小鼠 S180 实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其
13、抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的 70.4%78.2，提示具有有效的抗肿瘤生长作用。表 1 海藻提取物对小鼠 S180 实体瘤重量的影响（略）3.2Fucoidan 对体外培养 A549 细胞、HeLa 细胞和 L1210 细胞的影响结果见表 2。Fucoidan 对体外培养 A549 细胞、HeLa 细胞和 L1210 细胞的A570 均无显著影响。提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。表 2Fucoidan 对体外培养 A549 细胞、HeLa 细胞和 L1210 细胞 OD570 的影响（略）43.3Fucoidan 对正常小鼠免疫功能的影响结果见表 3。Fucoidan 中剂量组和大剂量组能显
14、著提高碳粒廓清实验中的廓清指数 K、吞噬指数 和脾脏器指数（P0.05 或 P0.01） ，且呈现明显剂量相关性，但对胸腺脏器指数影响不大。在 DNFB 诱导迟发性变态反应（DTH）实验中，Fucoidan 中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大（P0.05） 。表 3Fucoidan 对正常小鼠免疫功能的影响（略）4 讨论大量药理及临床研究表明，海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用4 ，特别是多糖成分，能提高机体的免疫功能，用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点5 。本实验结果显示，海藻提取物Fucoidan 能抑制小鼠移植性 S180 实体瘤的生长，具有确切的体内
15、抗肿瘤作用。而就其机制而言，活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能，尤其是非特异性免疫功能，而间接抑制或杀死肿瘤细胞的6 。碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验，能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力，活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用，在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。而 DNFB 诱导迟发性变态反应（DTH）是机体细胞免疫功能的另一敏感指标，反映 T 淋巴细胞功能。Fucoidan 能显著提高碳粒廓清实验中的廓清指数 K、吞噬指数 、脾脏器指数和 DNFB 诱导迟发性变态反应（DTH） 。但 Fucoidan 对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切
16、的直接抑制作用，这种对细胞无毒的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药。提示 Fucoidan 可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。【参考文献】1TakeshiTeruya,TerukoKonishi,ShuntokuUechi,etal.Anti-proliferativeactivityofoversulfatedfucoidanfromcommerciallyculturedCladosiphonokamuranusTOKIDAinU937cellsJ.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2007,40(3):221.2徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第 3 版M.北京：人民卫生出版社，2002：1785，1420.3陈奇.中药药理实验方法学，第 1 版M.北京：人民卫生出版社，1993：317.4杨文豪，
