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1、1注射用银杏达莫（冻干）安全性实验研究作者：沈祥春，江帆，任飞，史琴，彭佼【摘要】目的对注射用银杏达莫（冻干）进行肌肉刺激性、血管刺激性、豚鼠主动全身过敏反应、大鼠被动皮肤过敏反应及溶血实验，为其临床应用提供安全性实验依据。方法肌肉刺激性实验，观察 2 只家兔注射用银杏达莫（冻干）后48h 的变化。血管刺激性实验，观察连续用药 5d 注射用银杏达莫（冻干）及生理盐水，以及恢复 14d 后的注射局部血管和周围组织反应情况。豚鼠主动全身过敏反应，在第 1 次给药后 14d 及 21d，分别从足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干）观察注射后 15min 动物的过敏症状。大鼠被动皮肤过敏实验，采用 0.5
2、%伊文思兰溶液分析法。体外溶血实验，观察该品在 3h 内有无溶血和聚集现象。结果注射用银杏达莫（冻干）对家兔股四头肌、耳缘静脉未见明显刺激作用，对豚鼠主动全身过敏反应及大鼠被动皮肤过敏反应均未见明显过敏反应；未见明显体外溶血作用。结论注射用银杏达莫（冻干）的安全性实验结果提示其安全可靠。【关键词】注射用银杏达莫（冻干） ；安全性Abstract：ObjectiveToevaluatethesafetyofYinxingdamo(Freeze-driedPower).Injectedbytestingthemusclestimulation,vesselstimulation,activesys
3、tematicanaphylaxis,passivecutaneousanaphylaxisandhaemolytictest.MethodsInthemusclestimulationtest,tworabbitswereobservedat48hafterinjectionYinxingdamo(Freeze-driedPower);Inthevesselstimulation,fourrabbitswereobservedonthe5dafterinjectionYinxingdamo(Freeze-driedPower),andthereactionafterstoppedtreatm
4、ent14d.Activesystematicanaphylaxiswasinvestigatedbymaleguineapigs,reactionwasobservedthe14dand21dafterthefirsttreatment.TheratpassivecutaneousanaphylaxisreactionwasassayedbyEvansblue.Inthehaemolytictest,hemolysisandcoagulationweremainlyobserved.ResultsYinxingdamo(Freeze-driedpower)injectionhadnostim
5、ulationtomuscleandearveinofrabbit,theguineapigsandratshadnoallergicreactionascontrastandwithouthemolyticreaction.ConclusionYinxingdamo(Freeze-driedPower)injectionissafeandreliablebasedontheanimalexperiment.Keywords：InjectedYinxingdamo(Freeze-driedPower);Safetyevaluation银杏达莫注射液是贵州益佰制药有限公司的拳头产品，由银杏叶提取
6、物与适量双密达莫精制而成,为中西药复方制剂。银杏叶有效成分为:银杏黄酮苷、银杏苦内酯、白果内酯等,具有清除自由基,抑制细胞膜脂质过氧化反应,竞争性拮抗血小板活化因子,抑制蛋白激酶 C,降低细胞凋亡速度,修复损伤组织等作用1，2 。加入小剂量双密达莫后可进一步加强降低血液黏度,抑制血小板的活化2和聚集,增强红细胞变形能力及携氧能力,临床上用于动脉硬化、心脑血管疾病的防治。由于中药的液体制剂，无论是针剂还是口服制剂，都有可能在长时间放置后出现沉淀，从而导致不良反应的产生，一般是因为氧化和溶剂的极性发生了改变造成的。冻干粉针剂的冷冻干燥在低温下进行，物质中的一些有效成分损失很小，而微生物的生长和酶的
7、作用无法进行，能保持原来的形状；干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护；干燥能排除95%99%以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。基于冻干粉针剂的优点与中药注射液的缺陷，益佰药物研究所为提高品种的质量和临床用药的安全性，研制注射用银杏达莫（冻干） 。本次实验评价益佰药物研究所研制的注射用银杏达莫（冻干）是否符合静脉注射药物的安全性标准,为其进入临床应用提供实验依据。1 材料1.1 药物与试剂注射用银杏达莫（冻干） ，黄色冻干粉针剂，人用量(25 支溶于 500ml 生理盐水 2 次/
8、d)贵州益佰医药有限公司，批号 040805。卵蛋白，上海伯奥生物科技有限公司。百日咳菌苗，卫生部上海生物制品厂研究所。伊文思兰，中国医药(集团)上海化学试剂公司。1.2 动物日本大耳白兔、SD 大鼠、豚鼠等均由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-2001。2 方法2.1 药物的配制2.1.1 体外溶血、肌肉与血管刺激性实验药物配制 1 支粉针剂溶于 100ml0.9%的生理盐水中。2.1.2 豚鼠主动全身过敏反应高剂量组：1 支粉针剂溶于 6ml0.9%的生理盐水中，给药容积为 10ml/kg。低剂量组：1 支粉针剂溶于 12ml0.9%的生理盐水中，给药容积为 1
9、0ml/kg。卵蛋白：临用前用氯化钠注射液配成 0.5%浓度用于豚鼠腹腔注射，给药容积为 2ml/kg。激发给药药物配制：高剂量组：2 支粉针剂溶于 3ml0.9%的生理盐水中，给药容积为 5ml/kg；低剂量组：2 支粉针剂溶于 6ml0.9%的生理盐水中，给药容积3为 5ml/kg。2.1.3 大鼠被动皮肤过敏反应高剂量组：1 支粉针剂溶于 3ml0.9%的生理盐水中，给药容积为 10ml/kg。低剂量组：1 支粉针剂溶于 6ml0.9%的生理盐水中，给药容积为 10ml/kg。2.2 肌肉刺激性实验3取健康家兔 2 只，于本实验环境下饲养 1 周，以熟悉实验室条件。每只分别于一侧股四头肌
10、处以无菌操作方法注射，注射用银杏达莫（冻干）溶液 1ml；另侧相应部位同法注射等容积灭菌生理盐水作为对照。正常供应饲料和水。48h 后放血处死家兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应，按表 1 换算成相应的反应级分值。表 1 肌肉刺激反应分级标准（略）2.3 血管刺激性实验4取健康成年家兔 4 只，耳缘静脉注射药物 3ml/只(右耳)，在对侧耳注射生理盐水 3ml/只做阴性对照(左耳)。连续用药 5d。观察给药后不同时间注射局部血管和周围组织反应情况，如充血，水肿等。用药周期根据药物拟用于临床的情况定。在第 5 天用药后 4896h 对动物和注射部位进行肉眼多次观察和检查，处死
11、 2 只动物，取注射部位血管和周围组织进行组织病理学检查。14d 后，处死另外 2 只动物，送病理检查。2.4 豚鼠全身主动过敏反应实验3,5选择体重 300400g 的健康雄性豚鼠 24 只，按体重将豚鼠随机分成 4 组（每组 6 只） ，即生理盐水组、注射用银杏达莫（冻干）高剂量组（临床给药剂量的 10 倍）与低剂量组（临床给药剂量 5倍）和卵蛋白组。按注射剂过敏试验要求，分别给豚鼠隔日腹腔注射配置的注射用银杏达莫（冻干） 、生理盐水(10ml/kg)和 0.5%卵蛋白 0.5ml，共 3 次。将每组内分成两批，分别在第 1 次给药后 14d 及 21d 从足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干
12、）和生理盐水(5ml/kg)和 0.5%卵蛋白 2ml，注射后立即观察有无过敏症状，如兴奋不安、抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克甚至死亡等症状，持续观察3h。按表 2 分级，判定其反应级数。表 2 豚鼠过敏反应级数（略）2.5 被动皮肤过敏反应实验3，62.5.1 大鼠含 IgE 的抗血清制备取 4 只健康雄性 SD 大鼠，按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏实验的要求，分别腹腔注射注射用银杏达莫（冻干）药物10ml/kg(高、低两剂量组)，0.25%的卵蛋白生理盐水溶液 10ml/kg，生理盐水10ml/kg，同时腹腔注射百日咳疫苗 21010/只。13d 后眼眶取血，分离得血清，-20备用。2.5
13、.2 大鼠同种被动皮肤过敏反应实验取 40 只健康 SD 大鼠，雌雄各半。于本实验环境下饲养 1 周，并观察自主活动及一般状况。随机分成阳性药物组(卵蛋白组)空白对照组和注射用银杏达莫（冻干）高低两剂量组。在背中线两侧距脊柱约 1.5cm 处用 8%的硫化钠溶液脱毛，每侧 2 点，间隔 2cm。取上述含 IgE的血清，用生理盐水分别稀释为 15，110，120，140 倍，按不同浓度次4序，分别皮内注射于各组大鼠去毛各点。48h 后，注射用银杏达莫（冻干）组分别静脉注射含 0.5%伊文思兰的注射用银杏达莫（冻干）溶液 1ml 攻击，阳性药组静脉注射含 0.5%伊文思兰的 0.5%的卵蛋白生理盐
14、水 1ml 攻击，空白对照组静脉注射 0.5%伊文思兰的生理盐水溶液 1ml 攻击。30min 后处死动物，检查注射各点的蓝色反应斑。2.6 体外溶血实验7取健康家兔 1 只，自心脏取血约20ml，置于预先放有玻璃珠的三角瓶中，搅拌去纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水 510ml，混匀后离心 5min(20002500r/min)，去除上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗 34 次，至上清液无色透明，将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成 2%的混悬液。取试管 7 支，编号排列于试管架上，按表 3 加入各种溶液，第 6 管不加注射用银杏达莫（冻干）药液作为空白对照管；第 7 管不加
15、药液，用蒸馏水代替生理盐水，作为溶血的阳性对照组，将各管轻轻摇匀，在 37水浴中保温 3h，开始每隔 15min 观察 1 次。1h 后，每隔 1h观察 1 次，记录 3h。表 3 体外溶血实验配比量（略）全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。3 结果3.1 肌肉刺激性实验注射后不同时间观察结果表明股四头肌表面未见明显充血，红肿，家兔活动正常，未见明显异常反应。两只家兔 48h 后健康如常，解剖观察股四头肌，给药部位均有轻度红肿、充血等现象，评分 1
16、级。按照国家药品食品监督管理局新药（中药）研究办法的要求，以上试验结果提示，注射用银杏达莫（冻干）未见明显肌肉刺激性。3.2 血管刺激性实验每天注射后观察，双侧耳未见明显充血水肿，注射后 1h内，动物未见明显异常反应。病理组织学检查结果提示：给药结束左耳鳞状上皮无增生、萎缩，上皮下无充血、水肿及炎症；除 1 只动物右耳有轻微炎症反应发生，其余未见明显炎症反应。恢复 14d 后各动物左右耳均未见血管扩张和炎细胞浸润。本品对家兔血管未见刺激性。3.3 豚鼠全身主动过敏反应实验注射用银杏达莫（冻干）组与生理盐水组两批豚鼠分别于第 1 次给药后 14d 及 21d，由足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干）或生理盐水 5ml/kg，注射后豚鼠均未出现兴奋不安、呼吸困难、抓鼻、颤抖、竖毛、痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡等过敏反应，判定为 0 级，提示注射用银杏达莫（冻干）未见全身主动过敏反应；而阳性组卵蛋白组两批豚鼠分别于第 1 次给药后 14d 及 21d，足背静脉注射 0.5卵蛋白 2ml，注射后两批豚鼠在5m
