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1、1法罗培南对质粒介导 内酰胺酶的稳定性及抑酶作用研究【摘要】 目的 研究青霉烯类抗生素法罗培南对 14 种标准 内酰胺酶(TEM1 、TEM2 、TEM3 、TEM5 、SHV1 、SHV2 、SHV4 、SHV5 、PSE1、PSE2 、PSE3 、OXA1 、OXA2 和 OXA3) 的稳定性及抑酶作用。方法 采用紫外分光光度法，以其它 内酰胺抗生素(亚胺培南、美罗培南、头孢噻啶、头孢西丁、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢哌酮、氨曲南、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦)为对照。结果 所有抗生素对超广谱 内酰胺酶(TEM3 、TEM5 、SHV2 、SHV4 和 SHV5) 的 IC50 低于 1.9mo
2、l/L；但对广谱酶 TEM1 、TEM2 和 SHV1 的 IC50 超过 100mol/L。法罗培南对OXA1 、OXA2 和 OXA3 的 IC50 低于 1.0mol/L。法罗培南、亚胺培南、美罗培南和头孢西丁对 14 种标准 内酰胺酶均稳定。结论 法罗培南对 14 种 内酰胺酶的抑制作用强于亚胺培南和美罗培南。 【关键词】 法罗培南 内酰胺酶 稳定性 抑酶作用Study of stability and inhibitory activity ofABSTRACT Objective To study the stability and inhibitory activity of f
3、aropenem against 14 plasmidmediated standard lactamases (TEM1, TEM2, TEM3, TEM5, SHV1, SHV2, SHV4, SHV5, PSE1, PSE2, PSE3, OXA1, OXA2 and OXA3). Method The ultraviolet spectrophotometry was used with other lactams (imipenem, meropenem, cephaloridine, cefoxitin, cefuroxime, cefotaxime, cefoperazone,
4、aztreonam, clavulanic acid, sulbactam and tazobactam) as control. Results Faropenem, imipenem, meropenem and cefoxitin were very stable to 14 plasmidmediated lactamases. The IC50s of all tested antibiotics against extendedspectrum lactamases (TEM3, TEM5, SHV2, SHV4 and SHV5) were below 1.9mol/L. The
5、 IC50s of all antibiotics against broadspectrum lactamases (TEM1, TEM2 and SHV1) were beyond 100mol/L. The IC50s of faropenem against OXA lactamases (OXA1, OXA2 and OXA3) were below 1.0mol/L. Conclusion Faropenem showed stronger inhibitory activity than imipenem and meropenem against 14 plasmidmedia
6、ted lactamases.KEY WORDS Faropenem; lactamases; Stability; Inhibitory activity青霉烯类抗生素是基于青霉素与头孢菌素融合的概念，向青霉素骨架中引入双键，以增大 内酰胺反应性，提高抗菌活性的设想而设计合成的。它与现在广泛应用的碳青霉烯抗生素不同之处在于五元环上由硫代替了碳。与碳青霉2烯相比，青霉烯化合物也具有广泛的抗菌活性，同时对脱氢肽水解酶 2I(DHP2I)较碳青霉烯稳定，但抗铜绿假单胞菌活性低于碳青霉烯。对除铜绿假单胞菌外的需氧及厌氧革兰阳性菌、革兰阴性菌均显示出广谱抗菌活性1 。法罗培南为第一个口服的青霉烯类抗生
7、素，由日本 Suntory 公司开发，于 1997 年在日本上市。法罗培南在青霉烯母核的 2 位上接有一个四氢呋喃基团，化学结构稳定。本品对青霉素结合蛋白显示出强亲和力，尤其对金葡菌、耐青霉素的肺炎链球菌、粪链球菌等革兰阳性菌与脆弱拟杆菌等厌氧菌的抗菌作用明显优于头孢替安、头孢特仑、头孢克肟与头孢克洛等现有口服头孢菌素；对葡萄球菌属、链球菌属、流感嗜血菌、淋球菌等革兰阳性及革兰阴性菌的抗菌活性与上述头孢菌素相当或略优。本品对 内酰胺酶稳定，耐药菌株少，对头孢菌素耐药的弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等亦有良好作用24 。本品吸收和分布良好，临床广泛应用于各系统细菌感染的治疗5，6 。碳青霉烯类抗生素
8、在抗菌的同时对 内酰胺酶有程度不等的抑制作用，特别是对质粒介导的 内酰胺酶有良好抑制作用7，8 。为考察青霉烯类抗生素对 内酰胺酶的抑制作用，本文以头孢噻啶等抗生素为对照，测定了法罗培南及亚胺培南、美罗培南和帕尼培南等 3 种碳青霉烯类抗生素对 14 种质粒介导的标准 内酰胺酶的稳定性，并对其抑酶作用进行了研究。1 材料和方法1.1 药品法罗培南(faropenem，FRP，江苏正大天晴药业有限公司)；亚胺培南(imipenem，IMP，美国 Merck Sharp & Dohme 公司)；美罗培南(meropenem，MRP，英国 Zeneca 药厂)；头孢噻啶(cephaloridine，
9、CER，Sigma公司)；头孢西丁(cefoxitin，CFX，美国 Merck Sharp & Dohme 公司)；头孢呋辛(cefuroxime，CXM，Glaxo 公司)；头孢噻肟(cefotaxime，CTX，重庆制药六厂)；头孢哌酮(cefoperazone，CPZ，Pfizer 公司)；氨曲南(aztreonam，AZ，Squibb 公司)；克拉维酸(clavulanic acid，CA，中国药品生物制品检定所)；舒巴坦(sulbactam，SB，Pfizer 公司)；三唑巴坦(tazobactam，TB，Lederle 公司)。1.2 菌株14 株标准产酶菌由英国 London
10、大学赠送，分别产生质粒介导的TEM1 、TEM2 、TEM3 、TEM5 、SHV1 、SHV2 、SHV4 、SHV5 、OXA1、OXA2 、OXA3 、PSE1 、PSE2 和 PSE3 内酰胺酶。除PSE2 、PSE3 产酶株为铜绿假单胞菌外，其余产酶株均为大肠埃希菌。1.3 内酰胺酶的制备8取过夜培养菌液 2ml 转种于 200ml MH 肉汤中，37恒温摇床(SHZ22 型，江苏太仓医用仪器厂)振荡孵育 24h，4，5000g 离心(L860M 超速离心机，Beckman)30min，收集菌体并用 0.05mol/L 的 PBS(pH7.0)洗涤菌体 2 次，在冰浴3中超声破碎(V
11、irsonic 300 型超声细胞破碎仪，美国)菌体；在 4，20000g 离心菌液 1h，上清液即为粗酶液。用 内酰胺酶特异性鉴定试剂nitrocefin(Glaxo 公司赠品)鉴定产酶情况，再用等电聚焦法确证，保存于-70冰箱中。1.4 酶稳定性实验8以 0.05mol/L 的 PBS(pH7.0)配制 9 种 内酰胺抗生素，在药物加粗酶液前、后分别用分光光度计(DU650 ，Beckman 公司)作光谱扫描，选择吸收度值下降最大且稳定的波长为测定波长。底物浓度均为 10-4mol/L，在 3ml 底物中加入 20l 粗酶液，记录加酶前与加酶后 15min 的 A 值，计算酶对底物的水解率
12、，并以 CER 的水解率为 100%，分别计算其它抗生素的相对水解率。测定波长为：CER 260、CFX 262、CXM 275、CPZ 266、CTX 260、AZ 295、IMP 300、MRP 298、FRP 307nm。1.5 IC50 的测定8各取终浓度为0.005、0.015、0.045、0.1、0.4、1.0、4.0、10、25、100mol/L 的CA、SB、TB、IMP、MRP 和 FRP 与 20l 粗酶液混合放置 5min，然后加入 CER 按前述方法测定在抑制剂存在和不存在时酶对 CER 的水解率，以抑制剂的浓度为横坐标，抑制效率为纵坐标作图，根据曲线求出抑制效率为 5
13、0%时的抑制剂浓度，即为 IC50。按下列公式计算抑酶率：抑酶率=1-抑制剂存在时底物水解率无抑制剂时底物水解率100%2 结果2.1 内酰胺酶稳定性Tab.1 显示，FRP 对质粒介导的 14 种 内酰胺酶均高度稳定，相对水解率不超过 6%，与 IMP、MRP 等碳青霉烯类抗生素相当，远优于 CTX、CPZ、CXM 等第二、第三代头孢菌素；AZ 除对 TEM5 和 SHV4 相对水解率为 13%和 12%以外，对其余 12 种酶的相对水解率也不超过 7%；CFX 显示出对 14 种 内酰胺酶良好的稳定性，相对水解率不超过 11%。 2.2 抑酶作用Tab.2 显示，2 种碳青霉烯类抗生素 I
14、MP、MRP 对TEM1 、TEM2 、SHV1 、OXA1 、OXA2 和 OXA3 的 IC50 值均超过实验最大浓度 100mol/L，抑制效率差；FRP 对 TEM1 、TEM2 、SHV1 的 IC50 值也超过实验最大浓度 100mol/L，对其余 11 种酶 FRP 显示了良好的抑酶作用，IC50 值至少与 SB 相当。值得注意的是，2 种碳青霉烯类抗生素对OXA1 、OXA2 和 OXA3 型 内酰胺酶无抑制作用，而 FRP 显示了良好的抑制率，与 CA、SB 和 TB 相比，IC50 值高出 1 个数量级。43 讨论一直以来， 内酰胺抗生素以其安全、高效的特点在细菌感染治疗中
15、发挥着举足轻重的作用。随着 内酰胺抗生素的广泛应用，特别是第三代头孢菌素的大量使用，耐药菌株日益增多。细菌对 内酰胺抗生素产生耐药的机制主要有两种：PBPs 改变和产 内酰胺酶，而后者造成的细菌耐药更具临床意义9 。 内酰胺酶通过与 内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键使 内酰胺抗生素失活。随着近年来超广谱 内酰胺新品种的广泛应用， 内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度发展，目前从临床分离得到的 内酰胺酶已超过 340 种10 。从临床分离的耐药菌所产生的超广谱 内酰胺酶(ESBLs)大多数是由质粒介导的 内酰胺酶，与TEM1 、TEM2 和 SHV1 等广谱酶相比，ESBLs 不仅能水解青霉素和头孢菌素，还可水解第三代头孢菌素与单环类抗生素11 ，但对头霉素类与碳青霉烯类无影响12 。解决以上细菌耐药性的途径除了开发新的耐酶抗生素外， 内酰胺酶抑制剂的使用也是一个有效的手段，如临床广泛使用的舒巴坦、三唑巴坦和克拉维酸。这些物质本身并无抗菌活性，但它们通过抑制 内酰胺酶活性而达到保护 内酰胺抗生素的目的。近年来随着临床上耐 内酰胺酶抑制剂的细菌被陆续报道，对
