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1、特异性微小RNA-19a抑制剂 对 胃癌细胞增殖的影响,一、立 项 依 据,(一)胃癌概述,1.胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。 2.全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位. 3.早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。 4.胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移 5.肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物,(二)微小RNA,1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。 2.微小RNA分子(micro RNA, miRNA)是非编码的RNA分子(noncodin
2、g RNA, ncRNA), 对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。 3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用, 研究miRNA的表达, 尤其对其功能研究, 对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。,(三)胃癌组织中微小RNA的表达谱,芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA,Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4): 652-657,19种差异表达的微小RNA 12 7 miR-139
3、-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现 miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达,二、研究目标,microRNA-19a,胃癌细胞 microRNA-19a ,？,microRNA-19a抑制剂,本课题主要研究特异性微小RNA-19a的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。 初步假设：特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。,三、研究内容,设计并合成微小RNA-19a的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸（微小RNA抑制剂），用脂质体转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞，然后用实时定量逆转录-聚合酶链
4、反应技术检测微小RNA-19a的表达情况，最后用MTT法检测胃癌细胞的增殖情况。,四、可行性分析,微小RNA的抑制剂由生物公司合成并购买 细胞转染实验以及MTT法技术都已普及 实时定量-PCR基础二楼生化教研室可进行本实验,五、研究方案设计,材料,胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库） DMEM培养液（4C保存） 胎牛血清 RNA提取Trizol法试剂 转染Lipofectamine 2000试剂 实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒 通用逆转录引物 针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物 微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸
5、,方法,1、细胞培养 胃癌SGC-7901和MGC-803细胞在37度、含5%CO2的培养箱中培养。DMEM培养液中含有10%小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。 2、细胞转染 转染前1d , 选择生长状态良好的细胞胃癌细胞，以3105cells/well的密度接种6孔板，待细胞密度达到50%-70%后，用lipofectamine 2000转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养4小时后新鲜培养液。 3、细胞总RNA提取及实时定量RT-PCR检测微小RNA的表达水平 用Trizol试剂提取细胞内总RNA并测定RNA浓度，逆转录成cDNA，再按说明书进行实时定量PCR，以U6作为小RNA含量的参
6、照。PCR反应条件为：先95度15min热启动，然后按94度15s、60度30s、72度30s，共40个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小RNA的相对表达量用 方法来表示，,4、MTT法检测胃癌细胞增殖情况 以1.5 104cells/well接种胃癌细胞于96孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小RNA抑制剂阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长差异，在确定前2组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用3个不同浓度（0.50mol/L0.7mol/L1.00mol/L）的微小RNA抑制剂转染细胞，每组设3个复孔。48h后492nm和630nm双波长下检测吸光度（A）值，每
7、组取均值计算细胞抑制率。 5、统计学处理 数据用SPSS13.0软件分析，两组间均数比较用独立样本t 检测，结果用均数标准差（Xs）表示。,六、预期研究成果,特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小RNA-19a的表达，抑制了胃癌细胞的增殖。,七、经费预算,胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库） 两种试剂盒（购于生物公司） 总费用约5800元,八、参考文献,Tony Bou Kheir, Ewa Futoma-Kazmierczak, Anders Jacobsen Anders Krogh, Linda Bardram：miR-449 inhibits
8、 cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer Zhang Chun-zhi, Han Lei, Zhang An-ling, Fu Yan-chao, Yue Xiao, Wang Guang-xiu, Jia Zhi-fan1, Pu Pei-yu：RMeseiacrcrho arRticNleA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN 蒋振，郭俊明，肖丙秀：特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响,Thank You！,
