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1、1“离子色谱方法及应用”讲义张筑元2007 年 11 月1 方法原理1.1 离子色谱的创立离子色谱（以下简称 IC）是高效液相色谱的一种，是分析离子的一种液相色谱方法。液相色谱法（1906 年，俄国植物学家 Tswett ）： 1906 年色谱的发明者，俄国植物学家 M.S.Tswett，在研究植物色素的过程中， 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离并形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。纸色谱法：20 世纪 40 年代至 50 年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(t
2、hin-layer chromatography,TLC)。特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。气相色谱法（1952 年）：1952 年，James 和 Martin 提出了气相色谱法（gas chromatography,GC)。特点：以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。高效液相色谱法：20 世纪 60 年代后期由于新型色谱柱填料、高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC） 。高效液相色谱法的广泛应用始于 70 年代，经过三
3、十几年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟。其应用范围十分广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。据估计，目前已知的化合物中，有 80%的化合物需要用高效液相色谱进行分离分析。离子色谱法（1975 年， Small H ）：现代离子色谱开始于 Small H 及其合作者的工作，他们于 1975 年发表了第一篇 IC 论文，同年商品仪器问世。1.2 色谱法实质与目的实质：分离。目的：定性分析或定量分析。1.3 色谱法分类21.3.1 按两相分子的聚集状态分：类别 流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液相色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气相色谱气
4、体 液体 气-液色谱1.3.2 按固定相的固定方式分：柱色谱：包括填充柱色谱、毛细管柱色谱；平面色谱：包括纸色谱、薄层色谱、高分子薄膜色谱；1.3.3 按分离机制分：分配色谱，利用分配系数的不同；吸附色谱，利用物理吸附性能的差异；离子交换色谱，利用离子交换原理；空间排阻色谱，利用排阻作用力的不同。1.3.4 色谱法简单分类（按流动相）填充柱色谱法气相色谱法毛细管色谱法经典液相柱色谱法柱色谱法高效液相色谱法（包括离子色谱）纸色谱法液相色谱法平板色谱法 薄层色谱法超临界流体色谱法色谱法电色谱法1.4 液相色谱分类按分离机理分为：3类 型 分离机理 分析对象或应用领域吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分
5、离、族分离，制备 分配色谱 疏水作用 各种有机物分析与制备凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分子量及其分布测定离子色谱 离子性物质的分析手性色谱 立体效应 手性异构体分离，药物纯化亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体盐析色谱 溶剂化作用 蛋白质、非电解质分析1.5 离子色谱分类分离模式 分离机理 分析对象或应用领域离子交换 库仑力 无机和有机离子分析离子排斥 Donnan 平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛离子对 疏水作用 离子性物质分析离子抑制 疏水作用 有机弱酸弱碱分析离子分配 疏水作用 生物大分子金属配合物 疏水、螯合 金属离子1.6 不同分离模式所利用的溶质性质分离模式 所利用的物质的性质差
6、异离子交换 电荷与离子体积离子排斥 解离常数与疏水性离子对 (RP) 与离子对试剂之间的亲和力，离子对化合物的疏水性 离子抑制(RP) 在一定 pH 值下的疏水性反相分配(RP) 有机离子本身的疏水性41.7 离子色谱分析的对象物质离子类别 主要离子种类无机阴离子 卤素及简单阴离子、酸根阴离子、阳离子的配阴离子无机阳离子 碱金属、铵离子、碱土金属、过渡金属、稀土元素有机阴离子 有机酸、烷基硫酸、烷基磺酸、磷酸、多聚磷酸有机阳离子 胺、醇胺、铵盐、吡啶、生物碱、锍盐天然有机物 糖、醇、酚、醛、维生素生物物质 有机磷化合物、氨基酸、肽、核酸、核甙酸、蛋白质、碱基、抗生素1.8 离子色谱法的优点无机
7、阴离子分析的绝对优势。同时测定多种阴离子的快速、灵敏而准确的分析手段当首推离子色谱法。分析速度快。通常几分钟至十几分钟。对 7 种常见阴离子（F -、Cl -、Br -、NO 2-、SO 42-、PO 43-）和 6 种阳离子（Li +、Na +、 K+、Mg 2+、Ca 2+）的平均分析时间分别小于 10 分钟。用高效快速分离柱对上述 7 种最重要的常见阴离子的分离只需 3 分钟。检测灵敏度高。离子色谱分析的浓度范围为 g/Lmg/L。直接进样50L，对常见阴离子的检出限小于 1050L。选择性好。非离子性物质无保留。 多离子同时分析。离子色谱柱的稳定性高，使用寿命长。1.9 离子交换色谱基
8、本原理离子交换色谱分离机理主要是离子交换,是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换,依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。对树脂亲和力弱的离子较亲和力强的离子通过柱子快。常见阴离子 F-、Cl -、 NO3 -、SO 42-对树脂的亲和力依次增强。2 仪器构成2.1 常用仪器52.2 仪器构成：流动相输送系统、分离系统（分离柱） 、检测系统（检测器） 、数据处理系统 4 个部分。2.3 流动相输送系统离子色谱流动相要求耐酸耐碱系统，凡是流动相通过的管道、阀门、泵、柱子及接头等不仅要求耐压，而且要求耐酸碱腐蚀。流动相储存容器（玻璃或聚四氟乙烯，碳酸
9、体系需密封） 。在线脱气装置（惰性气体鼓泡吹扫、真空脱气 ） 。高压泵。对泵的基本要求：高稳定性，直接关系到分析结果的重复性和准确性；流量控制准确，精度通常要求小于0.5%；一般要求能够耐 2540MPa 的高压；泵的死体积要小，通常要求小于 0.5mL；能精确地调节流动相流量，流量测定精度约 0.1%。2.4 分离柱离子色谱仪的核心部件是分离柱。分离柱由分析柱和保护柱组成。常用分析柱内径：3.0, 4.0, 4.6, 8.0mm，长：50, 100, 150, 250mm。柱管材料是惰性的，一般均在室温下使用。固定相是分离柱（离子色谱）的核心。固定相种类：离子交换剂、两性离子交换剂、螯合树酯
10、、氧化还原树酯。最常用的固定相是离子交换剂。离子交换剂是一类带有离子交换功能基的固体微粒。其结构为在交联的高分子骨架上结合可解离的无机基团。在离子交换反应中，离子交换剂的本体结构不发生明显的变化，仅由其带有的离子与外界同电性离子发生等量的离子交换。离子交换剂种类：无机离子交换剂（如水合磷酸锆、钨酸锆、钼酸锆等） 、离子交换树脂（包括强酸型阳离子交换树脂、强碱型离子交换树脂、弱酸型、弱碱型、螯合型等） 。离子交换色谱的固定相具有固定电荷的功能基，阴离子交换色谱固定相的功能基一般是季胺基，阳离子交换色谱的固定相一般为磺酸基。2.5 检测器6离子色谱仪检测器分为 2 大类，即电化学检测器和光学检测器
11、。电化学检测器包括电导、支流安培、脉冲安培和积分安培；光学检测器包括紫外-可见和荧光。常用检测器是电导检测器，分为抑制型和非抑制型 2 种。离子交换色谱仪常用抑制型电导检测器。抑制器是电导检测器的关键部件。其主要作用是：降低背景电导，增大溶质电导；在线产生再生剂；显著提高电导检测器的灵敏度和选择性。电导检测器基本原理：离子的摩尔电导与浓度成正比关系。2.6 数据处理系统色谱工作站2.7 影响离子色谱分离的主要因素填料（功能基团种类、粒径及其分布）柱温（室温80 0C）流动相组成与浓度流动相流速（通常使用 0.5-2.0mL/min）流动相中的杂质成分3 实验技术3.1 样品预处理样品预处理的目
12、的主要是将样品转变成水溶液或水与极性有机溶剂（甲醇、乙腈等）的混合溶液；减少和除去干扰物；减少基体浓度；浓缩和富集待测成分，使之符合 IC 进样的要求，得到准确结果。IC 法灵敏度较高，一般用较稀的样品溶液。对未知液体样品，最好先稀释100 倍后进样，再根据所得结果选择适当稀释倍数，可减少超柱容量和强保留组分对柱子的污染。进样时须过滤除去颗粒物，用过滤器时必须事先洗净，待得到满意的空白后再用。若样品中含有有机污染物，最方便而有效的方法是将样品通过预处理柱。对有机物含量较高的工业污水，应先用有机溶剂萃取除去大量有机物，再通过预言处理柱。对固体样品，常用的方法是用水或淋洗液提取，若溶解不完全或溶解
13、速度7很慢，可在超声波或微波处理下用水或淋洗液提取。3.2 进样技术手工进样、自动进样。3.3 固定相制备技术球形、均匀的基质颗粒；分析填料：37um；制备填料：2040um功能修饰：键合与包覆（附聚）柱填充技术：高压、匀降柱尺寸：微柱(1mm） 、半微柱(1-3mm)新技术：整体柱,有序介孔材料3.4 淋洗技术淋洗液流速：流速和保留时间之间存在反比关系。增加流速，可缩短保留时间，提高分析速度；降低流速，可使保留时间延长，优点是改善分离效果。淋洗液的选取：抑制型电导检测阴离子交换色谱常用流动相抑 制 型 电 导 检 测 阴 离 子 交 换 色 谱 常 用 流 动 相淋 洗 剂N a 2B 4O
14、 7N a O HN a H C O 3N a H C O 3 + N a 2C O 3H 2N C H (R )C O O H + N a O HR N H C H (R )S O 3H + N a O HN a 2C O 3抑 制 产 物H 3B O 3H 2OC O 2 + H 2 OC O 2 + H 2 OH 3N + C H (R )C O O R N H 2+ C H (R )S O 3C O 2 + H 2 O 淋 洗 强 度很 弱弱弱中 等 强 度中 等 强 度中 等 强 度强阴离子交换色谱中，淋洗液类型和浓度主要由是否用抑制器来决定，而阳离子交换色谱中，此先决条件不是必须的
15、。对碱金属、铵、小分子脂肪族胺的分离，一般选用盐酸或硝酸，常用浓度 240mmol/L，若淋洗液浓度太大，会导致高的背景电导，降低用电导检测碱土金属离子的灵敏度。对碱金属和碱土金属的常规分析，推荐的分离柱是 CS12 柱，一次进样能同时分析碱金属、碱土金属和铵。3.5 抑制技术8作用：降低淋洗液背景电导，增加被测离子电导值，从而提高灵敏度。效果：灵敏度提高 12 个数量级。抑制剂（再生液）的提供（外加、在线电解） 。目前最先进的抑制器是美国 Dionex 公司生产的 SRS 型抑制器，它是微膜抑制器的改进和完善。3.6 无机阴离子分析淋洗液：一般情况下，只要弱酸在 pH8 时能以阴离子形式存在，其阴离子对固定相具有适当亲和力，这种弱酸的盐就可用作淋洗液。有机改进剂：有机溶剂可调节离子交换过程的选择性，改变分离柱对分析物的保留特性，从而改变洗脱顺序、峰效和分离度；可改善样品的溶解性，扩大 IC 的应用范围；使分离柱被有机物污染后的清洗成为可能。若在较长的洗脱时间来改善分离度，则应选用含有甲醇的淋洗液；为了缩短保留时间，则应选用乙腈。无机阴离子的洗脱顺序：决定离子对固定相的
