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1、第六章 双水相萃取法,谢 虹,普通的有机溶剂萃取法难于应用 于蛋白质的分离： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。 由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。,因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。 其中双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction,ATPS)，又称水
2、溶液两相分配技术(Partion of two aqueous phase extraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。,双水相,溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定的条件水相可以形成两相或多相； 1896年Bei jerinck 观察到把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，溶液分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分可溶性淀粉。,能够保留产物的活性; 整个操作可以连续化; 在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质25倍; 处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法，设备需用量要少310倍。,双水相萃取法的特点,双水相萃取法和传统的分离方法(如盐 析或有机溶剂沉
3、淀等)相比也有很大的优势， 如以-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃 取纯化的比较见下表。,用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。,第一节 双水相分离理论,当两种聚合物互相混合，分层或混合，取决于： 体系熵的增加； 分子之间作用力。 两种被混合分子间如存在空间排斥力，它 们的线团结构无法相互渗透，在达到平衡后就 有可能分成两相，形成双水相。,一、双水相的形成,当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集
4、同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。,聚合物的不相溶性,在生化工程中广泛应用的双水相体系有： 聚乙二醇（PEG）/葡聚糖(Dex)体系，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dex。 除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。,二、相图,水性两相的形成条件和定量关系常用相图表示。,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,图a和b分别为PEG/Dex和PEG/KPi系统的典
5、型相图,在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。,三、物质在两相中的分配,双水相中的分配平衡,与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。,有关双水相系统中溶质分配平衡的理论已有很多研究报导。但是，由于影响双水相系统中溶质分
6、配平衡的因素非常复杂，很难建立完整的热力学理论体系。从双水相萃取过程设计的角度出发，确定影响分配系数的主要因素是非常重要的。,已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:,lnm=lnme+lnmh+lnml,me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。,影响物质分配平衡的因素,体系的温度等,双水相系统的聚合物组成 (包括聚合物类型、平均分子量),盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值),溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点),这些系统复杂
7、性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。,双水相系统作为一种成功的萃取方法，很大程度上取决于使用的聚合物类型，当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：,聚合物组成的影响,完全混溶性(匀相溶液)；,物理的不相溶性(相分离)；,复杂的凝聚(相分离,聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中)。离子和非离子聚合物都可以使用在双水相系统的构成上，但是，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝
8、聚。,物理化学性质的影响,双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度()和两相间的密度差，黏度()和两相间的黏度差以及表面张力()。,系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是1。随着聚合物和成相盐浓度增大，,系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的界面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。,盐和缓冲液的影响,盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。,在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不
9、同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。,例如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。,温度的影响,温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分
10、配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。,大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离；(3)常温操作节省冷却费用。,第二节 双水相系统的应用,双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上都有很大的发展。在最近几年中更为突出,在若干生物工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋白质的分离和纯化，其应用举例如表所示。,欲提取的酶与细胞碎片应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，经过一次萃取
11、，就能得到较高的收率； 两相用离心机很容易分离。,思 考 题,何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？,从辣椒中提取辣椒红色素,辣椒红色素是从辣椒中提取的一种天然色系，属于类胡萝卜系色素由于它颜色鲜艳，色调多样，一经问世，便深受人们的喜爱。 辣椒红色素广泛应用于医药、高级化妆品中还广泛泛用于食品中的饮料、果汁、果酒、汽水
12、、糕点等，因此具有很重要的生产价值，辣椒红色素对人体无任何副作用，因此国际上规定ADI(人体每日允许摄入量)为“不限制”。,辣椒的主要成分是辣椒素和辣椒色素，以及具有特殊香味的挥发物。辣椒中产生辣椒味的物质是辣椒碱，辣椒红色素和辣椒碱能溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂和碱溶液中。 辣椒碱在辣椒中的含量一般为0.20.5%，但只要辣椒红色素中有十万分之一的浓度就可明显地感觉到辣味。由于辣椒碱对人体血管有刺激作用，所以在提取辣椒红色素的同时要除去辣椒碱。,干辣椒果皮,处理,辣椒粉,提取,乙醇提取物,柱层析,辣椒橙和辣椒红,乙醇一硅胶法,操作步骤,处理：收集干净的辣椒，去除籽及梗，将辣椒果皮用粉碎
13、机粉碎，过20目筛，然后将辣椒粉倒入回流瓶中。 提取：往回流瓶中加15-2倍量95的食用乙醇，在40左右回流34小时，收集紫红色油膏状的乙醇提取物。 柱层析：将乙醇提取物通过硅胶柱层析，用正己烷作洗脱剂，收集橙红色油状物。油状物中包含辣椒橙(油)及紫红色油状物(辣椒红)，进一步纯化即为产品。,干辣椒果皮,处理,辣椒粉,提取,丙酮抽提液,重结晶,产品,丙酮一石油醚法,操作步骤,处理：收集干净的辣椒，去除籽及梗，将辣椒果皮用粉碎机粉碎，过20目筛，然后将辣椒粉倒入回流瓶中。 提取：在回流瓶中加入15-2倍体积的丙酮反复抽提34小时，收集丙酮提取液。 重结晶：将丙酮液移入另一搪瓷桶中，加入石油醚，搅
14、拌均匀，置4重结晶过夜，然后收集结晶物，即为辣椒红色素产品。所得产品不溶于水，溶于乙醇、油脂及有机溶剂，耐热耐酸性好，耐光性较差。产品有不良气味和辣味，要去除辣味，方可用于化妆品中。,干辣椒果皮,处理,辣椒粉,萃取,乙醇提取液,盐析,粗品,乙醇一盐析法,产品,再提取,操作步骤,处理：收集干净的辣椒，去除籽及梗，将辣椒果皮用粉碎机粉碎，过20目筛，然后将辣椒粉倒入回流瓶中。 提取：往回流瓶中加入152倍量食用乙醇(95 %)，回流34小时，收集紫红色油膏状的提取物。 盐析：将收集的乙醇提取物移入搪瓷桶中，搅拌下加入精盐盐析34小时，除去辣味，收集盐析物。 再提取：将盐析物倒入另一搪瓷桶中，加入2倍量的95乙醇，搅拌提取2小时左右，然后回流回收乙醇，沉淀用少量无水乙醇(食用)洗1次，最后干燥即得精品。本产品色价为120，无有害物质。,干辣椒果皮,处理,辣椒粉,萃取,提取液,碱提取,处理液,正己烷法,酸溶液,调节PH值,提取,正己烷,粗品,精品,醋酸乙酯洗涤,
