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1、Western Blot 个人个人总结详细版总结详细版 单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例 中山大学临床检验诊断学硕士刘记 2016/11/14 1蛋白蛋白制样制样 A贴壁单层细胞贴壁单层细胞的处理：的处理： 1）60mm 细胞培养皿按 200ul/皿，准备 RIPA 裂解液【6 孔板 100ul/孔，按底面积换算，用 量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证 15ul 有足够的蛋白上样量】 2）使用前将 CockTail 按 1:100 加入 RIPA，混匀，冰上备用 3）收取培养上清后，预冷 PBS 洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止 BCA 培养基颜色干扰】 4）200ul/皿，加入 RI
2、PA 裂解液，冰上放置 5 分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞 5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的 EP 管，冰上放置 6）离心，4，14000Xg，15min 7）冰上操作，收上清至新标记好的 EP 管，冰上放置 BBCA 测定测定蛋白浓度：蛋白浓度： 按照碧云天 BCA 试剂盒说明书操作即可 1）收取蛋白样品稀释 10-20 倍测浓度 2）蛋白标准品在公用-20冰箱 2 层 C C蛋白蛋白浓度调整：浓度调整： 1） 根据 BCA 蛋白浓度测定结果， 按 15ul 上样体积 【15-20ul】 ， 40ug 总上样量 【30-100ug】 ， 等体积，等蛋白量上样调整
3、浓度至一致 2）加入 5XSDS 蛋白上样缓冲液 3ul，剩余 12ul 由上样蛋白和 PBS 补足 3）按照计算好的每个 15ul 总体积需要加入的蛋白体积，PBS 体积，5XSDS 蛋白上样缓冲液 体积，按 6 个 15ul 即 90ul 总体积，用量各 X6 配总体系【0.5mlEP 管】 ，煮沸 5min 后再分 装到每个小的 EP 管 4）用 0.5mlEP 管配总体系，煮沸 5min【使用 0.5mlEP 管，煮沸时不易进水】 5）分装至 0.2mlEP 管【不要用 0.2ml 的 EP 管煮沸，易进水，改变总体积】 ，-80保存备用 2 2SDSSDS- -PAGEPAGE A
4、A配胶配胶【以【以 1.01.0mmmm 厚度厚度 minimini 胶为例】胶为例】 1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶 2）选用新配置 AP，4保存 3） 将玻璃板洗洁精洗涤干净， 自来水冲洗干净， 烘箱烘干备用； 固定架上的软垫洗涤干净； 梳子洗涤干净，烘干备用 4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分 5）按照每块 mini 胶 5ml 用量配置分离胶，3ml 用量配置浓缩胶 6）加入 TEMED 后，迅速将分离胶倒入 15ml 离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接 近上缘， 最后用 1ml 加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘 【
5、此步骤速度要快， 防止凝固， 2 0 16 . 11. 14 刘记 导致分离胶上缘不平】 7）尽快用 1ml 加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平 8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问 题是 AP 失效 9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min 左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸 干 10）按照配方配置浓缩胶，加入 TEMED 后，用 1ml 加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡 11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置 30min【跟 室温和 AP 活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】 12）通过观察配浓
6、缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题 13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4保存过 久易出现裂胶】 B B蛋白上样蛋白上样 1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内 电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满 1X 的 SDS 电泳缓冲液 2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或 粘合】 3）蛋白上样，mini 胶每孔上样蛋白体积最好 15ul，最多不超过 20ul，否则容易出现蛋白样 品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现-actin 的相连成线，上样预染蛋白 marker，
7、并记录 蛋白样本次序，记住靠近 marker 的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋 白样本两侧各加一个泳道的蛋白 marker，向内压】 C C电泳电泳 1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极 2）打开电源开关，调整电压 80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳 3） 2h 左右， 观察溴酚蓝位置， 待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时， 终止电泳， 关掉电源， 拔下电极，盖子 3 3转膜转膜- -半干转法半干转法 1）预先配好 1L 干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液 2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液 3）用绿色塑料
8、小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做 标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手 术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶； 在电泳缓冲液里小心撬开分离胶， 用撬板拖入转 膜液内 4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸滤纸，NC 膜膜，分离胶分离胶，滤纸滤纸，每放入 一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下 NC 膜后即可用刀片在一角切除标 记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶 动 5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压 15V，40min，转膜 4 4
9、封闭封闭 1）转模后，用镊子小心将 NC 膜取出 2）在桌面保鲜膜上加少量 TBST，按照预知的目的蛋白分子量 KD 大小，参照预染 marker 位 置，用刀片切下 NC 膜，至少多切上下各 1 个 marker 位点 3）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 4）用 5%脱脂奶粉（TBST 配置） ，在抗体孵育盒内，每个格子加入 5ml，放入剪切好的 NC 膜 5）摇床，最小转速，室温孵育 2-3 小时 5 5孵孵一抗一抗 1）回收封闭液，4保存，一周可反复用三次 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或
10、者用 TBST 配置 5%BSA 作为一抗 稀释液】 4）每格加入 5ml 一抗稀释液 5）摇床，最小转速，4孵育过夜 6 6孵孵二抗二抗 1）回收一抗稀释液，4保存，可反复使用多次，不少于 6 个月 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）用封闭液 5%脱脂奶粉（TBST 配置）稀释二抗 4）每格加入 5ml 二抗稀释液 5）摇床，最小转速，室温孵育 2-3 小时 7 7化学发光化学发光 1）回收二抗稀释液，4保存，可反复使用多次 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）1:1 配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜 1ml 量
11、配置 4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml 加样枪，枪头，发光工作液 5）在化学发光仪上曝光拍照 8 8配置溶液配置溶液 1）10%SDS用于配胶，常温保存 2）AP新鲜配置，4保存 3）20%TWEEN配置 TBST 需要使用 4）转膜缓冲液按照配方配置 2X 储存液，用前单蒸水稀释至 1X 5）电泳缓冲液公用 5X 储存液，用前单蒸水稀释至 1X，或者按配方自己配置 6）TBS商品化粉末溶解即可 7）TBSTTBS 和 20%TWEEN 配置 8） 配胶所需其他几种成分 （30%丙烯酰胺， 0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8， TEMED） ， 5XSDS loading
12、buffer，TBS 粉末，可以购买商品化产品 9 9注意事项注意事项小结小结 1）电泳缓冲液可配置 2X 或 5X，使用之前用单蒸水稀释至 1X，最好不要用 PBS 稀释，影响 组分及导电性 2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置 2X，用前单蒸水稀释至 1X，干转 15V 恒压时初始电流 应在 800-900mA 才正常； 若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途， 湿转用转膜液， 15V 恒压转膜，初始电流 300mA 左右，不适合干转 3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔 4） 资料： 转膜用 NC 膜不分正反面， 注意孔径选择： 0.45m-大于 20KD， 0.2
13、2m-小于 20KD； 自己自己实验证明实验证明统一统一选用选用 0.45m 可以做出结果可以做出结果 5）丽春红染色主要目的是 NC 膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目 的蛋白位点的 NC 膜条带，剪下的 NC 膜用 TBST 洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封 闭；丽春红染色步骤可以省略丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置 6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于 TBST 中配置 5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于 2h 7）一抗用一抗专用稀释液或者 TBST 配置 5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质） ，4慢摇至少 孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可 4孵育过夜或两天， 不影响效果 8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于 2 小时 9）每次更换孵育液前用 TBST 进行洗膜，10min/次，洗涤 2 次，快摇 10） 剪切好的膜放在抗体孵育盒内， 进行封闭， 孵一抗， 孵二抗及洗膜过程中， 不用拿出膜， 可直接倾倒液体 11）加发光液前，将 NC 膜从 TBST 洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸 巾，防止蛋白脱落
