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1、Western Blot 个人个人总结详细版总结详细版 单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例 中山大学临床检验诊断学硕士刘记 2016/11/14 1蛋白蛋白制样制样 A贴壁单层细胞贴壁单层细胞的处理:的处理: 1)60mm 细胞培养皿按 200ul/皿,准备 RIPA 裂解液【6 孔板 100ul/孔,按底面积换算,用 量不能过多,不然后续蛋白浓度过稀,无法保证 15ul 有足够的蛋白上样量】 2)使用前将 CockTail 按 1:100 加入 RIPA,混匀,冰上备用 3)收取培养上清后,预冷 PBS 洗涤两遍【洗涤干净培养基,防止 BCA 培养基颜色干扰】 4)200ul/皿,加入 RI
2、PA 裂解液,冰上放置 5 分钟,轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞 5)冰上操作,细胞刮刷将细胞刮向一侧,加样枪收样到标记好的 EP 管,冰上放置 6)离心,4,14000Xg,15min 7)冰上操作,收上清至新标记好的 EP 管,冰上放置 BBCA 测定测定蛋白浓度:蛋白浓度: 按照碧云天 BCA 试剂盒说明书操作即可 1)收取蛋白样品稀释 10-20 倍测浓度 2)蛋白标准品在公用-20冰箱 2 层 C C蛋白蛋白浓度调整:浓度调整: 1) 根据 BCA 蛋白浓度测定结果, 按 15ul 上样体积 【15-20ul】 , 40ug 总上样量 【30-100ug】 , 等体积,等蛋白量上样调整
3、浓度至一致 2)加入 5XSDS 蛋白上样缓冲液 3ul,剩余 12ul 由上样蛋白和 PBS 补足 3)按照计算好的每个 15ul 总体积需要加入的蛋白体积,PBS 体积,5XSDS 蛋白上样缓冲液 体积,按 6 个 15ul 即 90ul 总体积,用量各 X6 配总体系【0.5mlEP 管】 ,煮沸 5min 后再分 装到每个小的 EP 管 4)用 0.5mlEP 管配总体系,煮沸 5min【使用 0.5mlEP 管,煮沸时不易进水】 5)分装至 0.2mlEP 管【不要用 0.2ml 的 EP 管煮沸,易进水,改变总体积】 ,-80保存备用 2 2SDSSDS- -PAGEPAGE A
4、A配胶配胶【以【以 1.01.0mmmm 厚度厚度 minimini 胶为例】胶为例】 1)按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶 2)选用新配置 AP,4保存 3) 将玻璃板洗洁精洗涤干净, 自来水冲洗干净, 烘箱烘干备用; 固定架上的软垫洗涤干净; 梳子洗涤干净,烘干备用 4)配胶用小烧杯洗净,倒扣纸巾吸干水滴,严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分 5)按照每块 mini 胶 5ml 用量配置分离胶,3ml 用量配置浓缩胶 6)加入 TEMED 后,迅速将分离胶倒入 15ml 离心管,迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接 近上缘, 最后用 1ml 加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘 【
5、此步骤速度要快, 防止凝固, 2 0 16 . 11. 14 刘记 导致分离胶上缘不平】 7)尽快用 1ml 加样枪加无水乙醇进行液封,将分离胶上缘压平 8)可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固,判断配胶是否出现问题,不凝固最常见问 题是 AP 失效 9)待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线,5min 左右,快速倒去无水乙醇,滤纸沿边缘吸 干 10)按照配方配置浓缩胶,加入 TEMED 后,用 1ml 加样枪迅速加满玻璃板,除去任何气泡 11)将洗净的梳子迅速斜行划入,垂直压下,观察严禁梳子下方出现气泡,静置 30min【跟 室温和 AP 活性有关,可放入湿度温箱加速凝固】 12)通过观察配浓
6、缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题 13)蛋白胶的保存,放入小袋,加少量单蒸水,保证胶润湿,常温保存可一周【4保存过 久易出现裂胶】 B B蛋白上样蛋白上样 1)将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起,小玻璃板向内,带字玻璃板向外,组成内 电泳槽,放入大电泳槽,内外槽均加满 1X 的 SDS 电泳缓冲液 2)在电泳缓冲液浸没的情况下,垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子,易致泳道破裂或 粘合】 3)蛋白上样,mini 胶每孔上样蛋白体积最好 15ul,最多不超过 20ul,否则容易出现蛋白样 品外溢,进入其它泳道或者曝光易出现-actin 的相连成线,上样预染蛋白 marker,
7、并记录 蛋白样本次序,记住靠近 marker 的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜,可以在蛋 白样本两侧各加一个泳道的蛋白 marker,向内压】 C C电泳电泳 1)按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子,插上电极 2)打开电源开关,调整电压 80V,观察电泳槽出现小气泡上浮,证明正在电泳 3) 2h 左右, 观察溴酚蓝位置, 待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时, 终止电泳, 关掉电源, 拔下电极,盖子 3 3转膜转膜- -半干转法半干转法 1)预先配好 1L 干转专用转膜缓冲液,向小瓷盘倒入一定量转膜液 2)将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液,准备干净的玻璃棒,镊子放入转膜液 3)用绿色塑料
8、小撬板将小玻璃板撬开,切除浓缩胶,立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做 标记,标注正面,如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散,可以在玻璃分离胶之前,用手 术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶; 在电泳缓冲液里小心撬开分离胶, 用撬板拖入转 膜液内 4)干转仪地面加少量转膜液润湿,从下向上一次放置滤纸滤纸,NC 膜膜,分离胶分离胶,滤纸滤纸,每放入 一层,立即用玻璃棒排出气泡,再加一定量转膜液;放下 NC 膜后即可用刀片在一角切除标 记正面;放下分离胶之后,玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行,轻轻赶 动 5)盖好转膜仪盖子,插上电极,打开开关,调整电压 15V,40min,转膜 4 4
9、封闭封闭 1)转模后,用镊子小心将 NC 膜取出 2)在桌面保鲜膜上加少量 TBST,按照预知的目的蛋白分子量 KD 大小,参照预染 marker 位 置,用刀片切下 NC 膜,至少多切上下各 1 个 marker 位点 3)摇床中等转速,TBST 洗涤 2 次,10min/次 4)用 5%脱脂奶粉(TBST 配置) ,在抗体孵育盒内,每个格子加入 5ml,放入剪切好的 NC 膜 5)摇床,最小转速,室温孵育 2-3 小时 5 5孵孵一抗一抗 1)回收封闭液,4保存,一周可反复用三次 2)摇床中等转速,TBST 洗涤 2 次,10min/次 3)用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或
10、者用 TBST 配置 5%BSA 作为一抗 稀释液】 4)每格加入 5ml 一抗稀释液 5)摇床,最小转速,4孵育过夜 6 6孵孵二抗二抗 1)回收一抗稀释液,4保存,可反复使用多次,不少于 6 个月 2)摇床中等转速,TBST 洗涤 2 次,10min/次 3)用封闭液 5%脱脂奶粉(TBST 配置)稀释二抗 4)每格加入 5ml 二抗稀释液 5)摇床,最小转速,室温孵育 2-3 小时 7 7化学发光化学发光 1)回收二抗稀释液,4保存,可反复使用多次 2)摇床中等转速,TBST 洗涤 2 次,10min/次 3)1:1 配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作,避光保存;按每张膜 1ml 量
11、配置 4)带上镊子,干净玻璃平皿,1ml 加样枪,枪头,发光工作液 5)在化学发光仪上曝光拍照 8 8配置溶液配置溶液 1)10%SDS用于配胶,常温保存 2)AP新鲜配置,4保存 3)20%TWEEN配置 TBST 需要使用 4)转膜缓冲液按照配方配置 2X 储存液,用前单蒸水稀释至 1X 5)电泳缓冲液公用 5X 储存液,用前单蒸水稀释至 1X,或者按配方自己配置 6)TBS商品化粉末溶解即可 7)TBSTTBS 和 20%TWEEN 配置 8) 配胶所需其他几种成分 (30%丙烯酰胺, 0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8, TEMED) , 5XSDS loading
12、buffer,TBS 粉末,可以购买商品化产品 9 9注意事项注意事项小结小结 1)电泳缓冲液可配置 2X 或 5X,使用之前用单蒸水稀释至 1X,最好不要用 PBS 稀释,影响 组分及导电性 2)转膜缓冲液最好自己配置,可配置 2X,用前单蒸水稀释至 1X,干转 15V 恒压时初始电流 应在 800-900mA 才正常; 若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途, 湿转用转膜液, 15V 恒压转膜,初始电流 300mA 左右,不适合干转 3)拔梳子禁止干拔,应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔 4) 资料: 转膜用 NC 膜不分正反面, 注意孔径选择: 0.45m-大于 20KD, 0.2
13、2m-小于 20KD; 自己自己实验证明实验证明统一统一选用选用 0.45m 可以做出结果可以做出结果 5)丽春红染色主要目的是 NC 膜上蛋白,判定是否成功转膜,并可助于染色条带剪切出目 的蛋白位点的 NC 膜条带,剪下的 NC 膜用 TBST 洗涤去除丽春红染色,放入孵育盒开始封 闭;丽春红染色步骤可以省略丽春红染色步骤可以省略,前提是清楚确定目的蛋白所在位置 6)封闭选用进口脱脂牛奶溶于 TBST 中配置 5%脱脂牛奶,室温慢摇不少于 2h 7)一抗用一抗专用稀释液或者 TBST 配置 5%BSA(不能用脱脂牛奶,易变质) ,4慢摇至少 孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用;一抗可 4孵育过夜或两天, 不影响效果 8)二抗用封闭液稀释,室温慢摇不少于 2 小时 9)每次更换孵育液前用 TBST 进行洗膜,10min/次,洗涤 2 次,快摇 10) 剪切好的膜放在抗体孵育盒内, 进行封闭, 孵一抗, 孵二抗及洗膜过程中, 不用拿出膜, 可直接倾倒液体 11)加发光液前,将 NC 膜从 TBST 洗涤液夹出,反面放在纸巾吸干液滴,不要正面摩擦纸 巾,防止蛋白脱落