rna的提取琼脂糖电泳及rtpcr

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1、（8：008：05）,实验回顾,实验一、基因组DNA的提取、 酶切及电泳,目的 DNA片段,质粒,TA载体,连接,重组质粒,目的 DNA,转化,无质粒的E.Coli 死亡,有质粒的E.Coli 存活,含抗生素培养基中生长,PCR,2-3min,平板筛选,实验二 RNA提取、逆转录PCR,实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取； 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳； 3、以总RNA为模板的逆转录反应； 4、以cDNA为模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次实验扩增GAPDH基因(746bp) 5、 PCR产物的电泳及回收,（8：058：15）,教师要有下午电泳时 播放的多媒体 PCR Flash 动

2、画 PCR在法医学上的应用,RNA提取操作注意事项,RNA分离的关键因素是减少RNA酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。 1、尽量避免外源性RNase 污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c.一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用RNase 抑制剂抑制内源性RNase 活性。,总RNA 真核细胞的RNA

3、主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 5鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构 20-200个A. 翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt,1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。 2）实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3）将研磨后的组织（小米粒大

4、小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4）室温孵育10 min。,（8：159：05）,发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。,第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA,1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大

5、、纯度高的优点。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,课间介绍 RNA提取的几种方法,室温孵育10 min,RNase抑制剂介绍,1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%-0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1.25mi

6、n。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 2、肝素 使用浓度：0.110mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制 效果。,室温孵育10 min 结束,5）加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体） 10, 000 rpm，离心 5 min (统一离心) 7）将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。,9：0510：05,RNA (清澈透明),DNA,Protein,第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA,RNA提取:,RNA (清澈透明),DNA,P

7、rotein,8）沉淀RNA：加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，(统一) 离心10 min，弃上清。 10）加1ml 75%乙醇洗涤。 11）7500rpm，4C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。,在用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行，当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。,离心10分钟时课间休息,注意： 75%乙醇的作用： 不起沉淀作用，只是为了清洗管壁 加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀,12）室温干燥35 min（根据RNA沉淀大小决定，干

8、燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）,注意事项：,RNA: 自然室温干燥 避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。 RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。,RNA pellet： 乳白色，透明胶样 干燥后无色透明,13）用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18 l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 14) 吸出 9 l溶液放到冰上备用(将用于电泳). 15) 剩余 9

9、l溶液,放到冰上备用（用于RTPCR）.,RNA的溶解：,注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。,避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度： 吹打时液体流动不拐弯为止。,逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。,RT第二部分：逆转录反应 (RT),mRNA,3-TTTTTT(18)-5

10、,68-70oC, annealing,3-TTTTTT(18)-5,37-42oC, RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,按照下列配方进行RNA的RT反应： 第一步： 总RNA 9l Oligo dT (0.05g/ml) 1l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65水浴10min后， 立即冰浴2min。,在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。,关键点： RNA是否充分溶解 根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录

11、反应体系。 引物的量是否合适 高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。 退火后一定迅速放在冰上,在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,将 RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品 23 l 上样液轻轻混匀， 上样 电泳: 120伏，1020分钟 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的

12、常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。,重点讲解28S、 18S和5S的比例。,分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。,RNA电泳结果分析,第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l 轻弹管底混合，可用离心机甩一下。 置42 oC 水浴1h。 将上述反应移至68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用。,（10：3011：30 由老师结束实验，放-20 oC，下午使用 ）,cDNA 4 l 10PCR buffer（含MgCl2） 5

13、 l dNTPs (10mmol/L) 1 l 5引物 (10mol/L) 1 l 3引物 (10mol/L) 1 l 去离子水（补足反应体系） 39 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）,注意：最后加入Taq 酶。,PCR 操作,50l,在一微量离心管中依次加入下列试剂：,PCR仪设定的反应条件： 94oC 45 S DNA变性 55 oC 45 S DNA复性 72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min,根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件

14、进行PCR。,PCR仪介绍：,如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；,如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。,PCR反应期间讲解： 1：203：00,PCR仪内发生的反应,1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是PCR产物的污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。 2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。,PCR反应注意事项：,根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于50

15、0bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延伸时间2-3分钟。 变性 温度一般选用941oC，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用30秒。 退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。 引物长度一般在15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T),如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？,RT的引物选择：,Oligo (dT)15-18,Specific anti-sense primer,Random primer,因为基因序列与mRNA序列是一致的。,病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？,正链RNA病毒：RT引物用anti-sense primer； 负链RNA病毒：RT引物用sense primer。,1.为什么要加入镁离子？ 镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，2.0mM的浓度时酶活性最高。镁离子