亲和分离技术

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1、第六章 亲和分离技术,6.1 亲和萃取 6.2 亲和沉淀 6.3 亲和膜技术 6.4 分子印迹分离技术 6.5 亲和反胶团萃取技术,6.1 亲和萃取,亲和萃取简介 亲和配基高聚物的合成 亲和分配的影响因素和亲和模型 亲和分配的应用,6.1.1 亲和萃取简介,萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。,亲和萃取简介,常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质,6.1.2 亲和配基高聚物的合成,亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分

2、配在体系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通过化学方法结合在PEG上。,主要包括以下两种: PEG 的活化 亲和配基直接反应,6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型,影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如PEG浓度，还有: 配基浓度 配基载体 染料配基 pH: 增加，效率降低 温度: 升高，效率降低 盐浓度,亲和分配的影响因素和亲和模型,盐对分配系数的影响,亲和分配的影响因素和亲和模型,体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时,亲和分配的影响因素和亲和模型,整个过程的自由能变可以列成如下算式,G5G1G2G3G1,有N个结合位点的蛋白质而言,亲和分配的影响因素和亲和模型,推导

3、得,目标蛋白质的结合位点不被配基聚合物饱和时,6.1.4 亲和分配的应用,乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配,6.1.4 亲和分配的应用,葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化,6.1.4 亲和分配的应用,葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化,6.2 亲和沉淀分离技术,亲和沉淀的原理 亲和沉淀聚合物和亲和配基 亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基 亲和沉淀的展望,6.2.1 亲和沉淀的原理,亲和沉淀的机理：,亲和沉淀原理图,亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性识别与沉淀分离相结合的纯化技术。,亲和沉淀的优点,溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间

4、位阻，亲和结合速度快，结合充分； 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率,亲和沉淀机理,一次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation),亲和沉淀的机理分为两种,一次作用亲和沉淀,水溶性化合物分子偶联有两个或两个以

5、上的亲和配基，即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand) 通过与多价蛋白质(multivalent protein)支联，在适当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原抗体的沉淀作用相似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率最高。,一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别是4价以上的蛋白质 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用上存在较大难度。 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配基自交联(ligandself-assoliati

6、on)的现象，成为交联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。,一次作用亲和沉淀,二次作用亲和沉淀,制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。,二次亲和沉淀分离蛋白质示意图,6.2.2 亲和沉淀聚合物和亲和配基,典型的亲和沉淀有以下步骤： 亲和沉淀介质的制备 将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中

7、聚合物亲和配基目标蛋白的沉淀: 通过降低聚合物的 溶解度来实现,聚合物发生可逆性沉淀的方法： pH、温度、离子强度的改变 金属离子的添加 水溶性有机溶剂的添加等,选用何种方法取决于使用的配基载体，有时几种方法联合使用,典型的亲和沉淀有以下步骤（续）： 离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分 离出来 目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所 使用的方法大致相同，如改变pH值或离子强度来降低目 标成为与配基的亲和作用力。 配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白 复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需 要采取凝胶过滤等方法分离,亲和沉淀的有机聚合物，主要是可逆性沉

8、淀聚合物即亲和载体(affinity carrier)或可逆性溶解聚合物 可逆性溶解聚合物SIS（ Soluble and Insoluble Polymers）溶解和非溶解状态可随环境参数如pH、温度等的变化发生可逆变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和沉淀。 可逆性溶解聚合物可以直接和蛋白质结合发生亲和沉淀，但有时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。,亲和沉淀可逆性聚合物,二次亲和沉淀选择可逆性聚合物的原则： 包含活性基团，以便亲和配基能够结合； 不能和亲和配基强烈结合，以免配基不能和目标分子作用； 在一定条件下可以发生明显的可逆性的沉淀和溶解； 分子量分布窄； 可形成紧密的沉淀； 易回收，有

9、一定循环操作次数； 廉价易得,亲和沉淀可逆性聚合物,(1) 天然的可逆性溶解聚合物,目前所使用的天然亲和配基载体主要是脱乙酰壳聚糖(chitosan)和藻酸盐(alginate): Chitosan在pH低于6时是可溶性的，升高pH值则会发生 沉淀 藻酸盐是D甘露糖醛酸和L葡萄糖醛酸的线性多聚 物，在二价阳离子如Cu2+的存在下或pH低于2的条件下 形成沉淀,Senstad和Mattiasson将大豆胰蛋白酶抑制剂(soy bean trypsin inhibitor,STI)共价偶联到亲和配基载体Chitosan上，制成亲和沉淀介质 结合胰蛋白酶(trypsin) 用0.1M的NaOH调节溶

10、液PH值至8.5，介质与胰蛋白酶一起沉淀，离心 用0.1M的glycine-盐酸缓冲液清洗，胰蛋白酶与配基STI解离（此时PH约2.5），胰蛋白酶收率为86。 研究表明，为了使沉淀更完全，应适当延长时间，因为亲和作用进行很快，但沉淀步骤相对来说要缓慢得多。,(1) 天然的可逆性溶解聚合物(应用pH 敏感性),孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体(Polymerized Liposome, PLS)。 磷脂酰乙醇胺的水悬浮液在超声波处理下形成0.1-0.2mm的球形液泡状磷脂双分子膜，即脂质体(liposome)，表面为亲水性乙醇胺基团。 该脂质体溶液在紫外线照射下可发生

11、聚合反应，形成聚合脂质体，即PLS。,向PLS溶液加入NaCl，当NaCl浓度超过0.17mol/L时，在渗透压作用下PLS发生快速完全的沉淀。 离心回收沉淀后向其中加入水或低浓度盐溶液，沉淀重新溶解。,(2) 合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性),可逆沉淀性聚合物 聚合脂质体（polymerized liposome,PLS）,PLS具有在盐的作用下发生可逆性沉淀的性质。 将大豆胰蛋白酶抑制剂（STI共价偶联PLS的表面，制成亲和沉淀介质STIPLS。 加入猪胰提取液中，用0.1M的NaCl沉淀，离心，并用0.01M的NaOH洗脱胰蛋白酶。 结果表明，此法亲和沉淀的胰蛋白酶收率在80以

12、上，纯化倍数达到8，比活达到13000U/mg，接近纯酶的水平。 PLS的优点是，在很宽的PH值范围内和有机溶解中均表现出良好的稳定性，经配基修饰后具有很好的蛋白质亲和沉淀特性：蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。,(2) 合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性),可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺,亲和配基载体Eudragit S-100，它是甲基丙烯酸(methacrylic acid)和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)的聚合物。 Eudragit S-100在PH低于5时发生可逆性沉淀；在(NH4)2SO4或PEG8000存在的情况下，沉淀发生的PH值相对高一些。 Eu

13、dragit与亲和配基染料Cibucron Blue的复合物Eudragit-Cibacron Blue在Ca2+存在的条件下，温度达到40，在任何PH值范围内都会发生可逆性沉淀。 这就扩大了Eudragit的应用范围，尤其是对那些在酸性条件容易变性的酶类。,(2) 合成可逆性溶解聚合物,亲和沉淀的亲和配基,在很多情况下，亲和沉淀时将亲和配基固定在可逆性溶解聚合物上，亲和沉淀的亲和配基和亲和层析的配基没有太大差异，包括生物专一性配基如辅酶、蛋白质A及非专一性亲和配基如染料、金属离子等。 采用双金属离子螯和的双功能试剂，将金属离子固定在一些可以固定金属离子的二聚物如poly-VI-VCL和pol

14、y-VI-PIPAM。这些聚合物上有多个咪唑基，可以结合金属离子Cu2+。Cu2+-poly-VI-NIPAM已成功地用来沉淀分离大豆蛋白酶抑制剂；Cu2+-poly-VI-VCL可用于分离纯化乙酸脱氢酶。,poly-VI-NIPAM,poly VI-VCL,亲和沉淀的亲和配基,6.2.3 亲和沉淀的展望,亲和沉淀是一种简单、高效的分离纯化技术，已在多种蛋白的分离纯化中应用。,pH敏感性亲和沉淀 热诱导亲和沉淀 离子强度敏感性的亲和沉淀 亲和沉淀和其他技术的集成 制备规模的亲和沉淀,(1) pH敏感性亲和沉淀,pH敏感性聚合物本身带有电荷，当它的净电荷减少时，溶解度降低而发生沉淀，通过改变pH

15、值改变其溶解状态，以此类聚合物作为载体结合亲和配基用于亲和沉淀。pH敏感性聚合物包括： 天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖(chitosan)、藻酸盐 (alginate)、纤维素衍生物（cellulose）； 合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-丙烯酰-p-氨基苯酸、N- 丙烯酰-m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸(methacrylic acid)和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)的聚合 物，异丁烯酸-异丁烯酸甲酯共聚物等,对某些可逆溶解性聚合物，通过改变温度可改变溶解度。在亲和沉淀中使用的热聚合物用于蛋白质的分离纯化时，能够进行特异性沉淀，称为热诱导亲和沉淀。其原理是利用

16、双官能团试剂，其中一部分功能基团与被分离的生物分子特异性结合，另一部分功能基团在介质性质尤其是温度变化后能形成沉淀。,(2) 热诱导亲和沉淀,对氨基苯甲眯结合到异丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋白酶的热亲和沉淀聚合物，将这种沉淀剂加入胰蛋白酶提取液中形成以蛋白酶-聚合物复合体。 滤液中剩余的酶活仅为原酶活的7%。过滤得到沉淀复合物，加入缓冲液中加热，使胰蛋白酶和聚合物脱离，得到分离纯化的酶。 热诱导亲和沉淀可以和亲和配基如金属离子结合起来，如Cu-IDA-PVCL是一种人诱导聚合物，可用于乙酸脱氢酶的分离纯化。,(2) 热诱导亲和沉淀（应用）,(3) 离子强度敏感性的亲和沉淀,此类聚合物在很宽的pH范围内对有机溶剂表现出良好的稳定性，当添加或除去盐是发生可逆性沉淀。 孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体(Polymerized Liposome,PLS)具有这种性质，这在前面已经叙述过。,