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1、1微波辅助提取及气相色谱-质谱联用分析苍术挥发油成分作者：王道武，于威威，陈志敏，赵全成，张龙【摘要】首次采用微波辅助提取及气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析苍术中挥发油成分。得出微波辅助提取的最佳条件：提取溶剂 V(乙醇)V(石油醚)=21，药材颗粒度为 0.0500.150mm，料液比为 140，提取时间为25min。GC-MS 分离出 88 个化合物，鉴定出 74 种挥发油成分，在 40min 内即可达到良好的分离。各组分相对保留时间的相对标准偏差 RSD 小于 0.15%，相对峰面积的 RSD 小于 3.0%，挥发油提取率达 4.419%。【关键词】苍术;挥发油;微波辅助提取;分析苍
2、术是中国传统的有较高价值的中药，属菊科多年生草本植物，主要分布在江苏、湖北、山东等地。入药用其干燥根茎，性温、味苦甘、无毒，入脾胃经，具有健脾燥湿、祛风、散寒的作用，临床上主要用于治疗湿阻脾胃、腹泻、水肿、风湿痹痛、风寒感冒等病。苍术中的化学成分主要有挥发油、苷类、有机酸、蛋白质等1。有关苍术挥发油成分的提取目前多采用传统提取-即水蒸气蒸馏法、索氏提取等方法24，但这些方法都普遍存在着耗时、低效的缺点。近年出现的微波辅助提取(MAE)法克服了这些缺点，具有消耗溶剂少、萃取效率高等特点被广泛应用于植物药的提取中，是一种理想的中药提取技术，主要集中在多糖、黄酮、皂苷类化合物的提取中58。对挥发油成
3、分的提取比较少，本研究首次采用微波辅助提取及 GC-MS 联用测定苍术中挥发油成分的分析方法，获得了最优提取条件,鉴定出 74 种挥发油成分，比文献报道的超临界法要高912，对不同提取方法(传统水提、索氏提取法、微波辅助提取法)也进行了对比分析。1 村料微波辅助提取仪-上海 SINEO 新仪，常压微波辅助合成萃取应用仪，微波炉腔内的反应器体积可大可小(25500ml)，具有磁力搅拌和机械搅拌两种设计，方便、快捷、实用。气-质联机采用 HP-6890 气相色谱仪连质谱检测器(MSD-5973)。内标溶液的配制：准确移取分析纯苯胺 10l 于检测用样品瓶中，加无水乙醇稀释到 1.0ml，摇匀，得
4、1.021710-2g/ml 内标溶液。2 方法2.1 色谱与质谱条件气象色谱条件：色谱柱 HP1ms，进样口温度：260，程序升温方式，初温 60保持 3min，第 1 阶段升温速率 10/min，升温至 100，保持 0min;第 2 阶段升温速率 5/min，升至 250，保持 7min;运行时间为240min。载气为 He，流速 1.0ml/min,不改变压力，无分流。质谱条件：EI 离子源，电子能量 70eV，离子源温度 230，m/z 扫描范围 50500，溶剂延迟3min。2.2 样品前处理苍术药材采购于河北康派中药材有限公司，粉碎过筛分成0.0500.150mm，0.1500.
5、355mm，0.3552.000mm，2.0005.000mm4 种不同颗粒度的样品，于烘箱中(70)烘干，备用。准确称取 1.0g 苍术样品于与微波炉配套的圆底烧瓶中，定量加入萃取溶剂，放入搅拌子，在提取仪内安置好;打开开关，设置温度、时间、转速等条件;运行完毕，冷却，取出抽滤;滤液再用减压旋转蒸发仪蒸干，再用无水乙醇溶解，定容到 25ml 容量瓶中，待测。吸取1.0ml 溶液于样品瓶中，精确加入 10l 内标溶液，摇匀，即为供试样品溶液。3 结果与讨论3.1 微波辅助提取条件的选择本试验采取两种对比的方法：采取色谱图中所有挥发油成分的峰面积总和对比的方法。每个样品检测 3 次，得到峰面积，
6、然后取平均值。挥发油中化合物个数的比较，选取 3 次检测中峰型最好的总离子流图作为分析对象，分析出属于挥发油成分的化合物个数，并记录化合物出峰的保留时间、名称、分子式、分子量、匹配度和相对含量等，以便进行之后的数据分析处理。3.1.1 提取溶剂在微波条件下，提取效果与溶剂有直接关系。极性溶剂很容易吸收微波，并将其转化成热能;而非极性溶剂接受微波能力就较弱，不能单独使用，但它对挥发油有较好的溶解能力。本试验进行了单一溶剂(乙醇、丙酮、石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯)的试验，发现乙醇、丙酮、石油醚单独的效果较好，又研究了混合溶剂(乙醇与石油醚混合、丙酮与石油醚混合)的研究，结果显示乙醇与石油醚混合溶剂
7、效果最好。于是进一步研究了乙醇与石油醚最佳配比试验分别取 0.51，11，1.51，21，31 几组比例，试验表明 V(乙醇)V(石油醚)=21 时总峰面积和化合物个数都达到最大(见图 12)混合溶剂提取效果最佳，因此选其为萃取溶剂。图 1 溶剂混合比例与峰面积的关系图 2 混合溶剂比例与挥发油中化合物个数的关系 3.1.2 提取温度试验表明将提取温度控制在接近溶剂沸点温度能达到最佳提取效果，因此选择提取温度为 40，结果显示，在 40下苍术挥发油能很好地溶于溶剂中，而且在此温度下挥发油成分不至于挥发出去。3.1.3 单因素实验设计方案准确称取 1.0g 苍术粉末，溶剂为 V(乙醇)V(石油醚
8、)=21 混合溶剂。料液比：(提取时间 20min，颗粒度 0.1500.355mm)分别选取 110，120，130，140 做试验，见图 34。图 3 料液比与峰面积的关系图 4 料液比与挥发油中化合物个数的关系结果显示，提取率随溶剂用量的增加先增后减，130 最优。溶剂太少时，提取不完全，且温度急剧上升容易破坏挥发油成分;溶剂太多时，传热太慢，提取效果反而不好，另外也浪费提取溶剂，但化合物的个数随着溶剂的增加而增加，但谱库的检索当达到 130 后增加的化合物基本不是挥发油的特征物质，所以选择溶剂比例为 130。提取时间(min)：保持料液比 130，颗粒度 0.1500.355mm，分别
9、选取310，15，20，25min 做实验，见图 56。图 5 提取时间与峰面积的关系图 6 提取时间与峰面积的关系随提取时间的延长，峰面积迅速升高，并趋于稳定，随提取时间的延长，挥发油中化合物个数也略有上升趋势，但超过 20min 后迅速下降。这是因为时间太短，提取不完全;时间太长，破坏挥发油成分且挥发油有损失，并且随着提取时间的加长挥发油组分数量并没有增加甚至减少所以选择 20min。颗粒度：保持料液比 130，提取时间 20min，选取0.0500.150，0.1500.355，0.3552.000，2.0005.000mm 颗粒度粉末做试验，见图 78。图 7 颗粒度与峰面积的关系图
10、8 颗粒度与挥发油中化合物个数的关系随着颗粒的增大，峰面积迅速下降，挥发油中化合物个数也迅速减少。说明在挥发油微波辅助提取过程中被提取物的粒度还是对提取率影响很大，粒度越小越有易于挥发油的提取。3.1.4 正交试验设计方案通过单因素实验确定各反应因素的范围后设计正交实验，选择药材料液比(A)、提取时间(B)、颗粒度(C)作为考察因素，以挥发油的提取率为评价指标，用 3 因素 3 水平的设计表安排实验，见表 1。表 1 三因素三水平的设计表3.2 方法学研究为检验分析方法的可靠性，对内标的选择、方法精密度与准确度做了相应研究，并用传统水提和水浴回流提取与 MAE 提取方法进行了对比。3.2.1
11、内标的选择分别内标溶液和样品溶液 1l，在相同分析条件下进行，得相应色谱图，见图 910。图 9 内标物苯胺的色谱图苯胺保留时间为6.419min，样品溶液的保留时间主要集中在 1535min 之间，且在 6.419min 时没有峰出现。苯胺色谱峰出峰位置不与样品溶液相干扰，而且样品成分中不含苯胺，这说明苯胺是合适的内标物质。重复进样 5 次，测得苯胺的峰面积的 RSD为 0.23%，保留时间标准差为 0.03min。完全满足内标物的选择，另外为避免苯胺易被氧化的特点，内标物溶液采用现用现配的方法，从而保证了它的准确性。图 10 样品溶液的总离子流图3.2.2 与传统水浴回流提取方法对比为了考
12、察 MAE 法的优越性，对传统水浴回流提取法和 MAE 法提取的样品溶液进行了对比分析。在保证同等质量苍术(1g)、相同溶剂V(乙醇)V(石油醚)=21、相同料液比(140)、相同提取温度(40)、相同提取时间(25min)、相同颗粒度(0.0500.150mm)条件下，MAE 提取液中挥发油成分要多于水浴回流提取，且峰面积也远大于水浴回流提取，以挥发油中主要成分桉叶醇为参照，微波辅助提取 25min 所得的相对峰面积与水浴回流提取 60min 所得相对峰面积相当，这就充分说明了 MAE 法快速、高效的特点。见图 1112。A-传统水提 B-水浴回流 C-最优条件图 11 不同提取法与峰面积的
13、关系 A-传统水提 B-水浴回流 C-最优条件图 12 不同提取方法与挥发油中化合物个数的关系3.3 微波辅助提取挥发油的 GC-MS 分析 GC-MS 总离子流图(图 13)显示，苍术挥发油成分在 40min 内可以完全达到基线分离，挥发油类成分占 98.7%，共分离出 88 种化学成分，用标准质谱检索库计算机检索鉴定出 74 种挥发油成分，匹配分数都达到 50%以上。挥发油提取率达 4.419%。表 1 归纳出鉴定出的挥发油成分4及其相对含量，其中主要成分是萜烯类及其氧化物，正是苍术作为中药的有效成分。主要有：桉叶烯、苍术醇、萘烯及其氧化物、萘醇及其氧化物、水芹烯、石竹烯、长叶烯、异长叶烯
14、、芹子烯、甜没药醇、苯并呋喃及其氧化物等，比现有苍术挥发油报道的有效成分含量和个数都要高。主成分的提取率通过内标物和如下公式算得，并归纳于表 1 中具体公式如下：C 挥发油中某化合物 S 挥发油中某化合物=C 内标物 S 内标物 C 内标物=n=mMv=M 其中=1.02173g/cm3=10lM=93=1.0ml 所以，C 内标物=1.0986103mol/LS挥发油中某化合物和 S 内标物是峰面积，都是已知数据，从而得到 C 挥发油中某化合物，m 化合物=C 化合物M 化合物(v=1.0ml)总得率=m 化合物图 13 最优提取条件下样品溶液的总离子流图表 1 苍术挥发油成分定性分析图【参
15、考文献】1王喜习，刘建利，刘竹兰.苍术属植物化学成分研究进展J.中成药，2008，30(7):1039.2李西林，须丽茵，栾晶.北苍术挥发油的提取与成分分析J.上海中医药大学学报,2008,22(1):59.3杨凌，欧阳臻，韩丽，等.茅苍术挥发油提取方法的比较研究J.时珍国医国药，2007,18(5):205.4张桂芝.GC-MS 法分析苍术饮片挥发油的化学成分J.现代中药研究与实践,2008,22(6):59.5李文最.微波技术在食品分析中的应用与进展J.中国卫生检验杂志，2006，16(1)：120.6何兵存，王义娜.微波辅助提取香菇多糖的工艺研究J.中国农业通报，2007，23(11)：
16、162.7王瑾，周建平.油茶籽多糖微波辅助提取及纯化J.中国油脂,2009,34(4):50.8陈双，史俊燕，钟洁.微波辅助提取小麦麸皮总黄酮技术研究J.食品与药品,2009,11(03):18.9赵颖，宋丹，江怀仲，等.GC-MS 联用技术分析苍术超临界 CO2 萃取物成分J.中成药,2008,30(2):1819.10杨凌，欧阳臻，宿树兰，等.茅苍术挥发油超临界萃取工艺及气质联用分析J.江苏大学学报(医学版),2007,17(5):393.11许腊英，田连起，刘先琼，等.苍术炮制品超临界 CO2 萃取和萃取物的紫外光谱分析J.湖北中医学院学报,2005,7(4):22.512李迎春，曾健青.北苍术超临界 CO2 萃取产物的成分J.分析测试学报，2001，20(1):
