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1、一 造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按41比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 按体积比为(1.52)1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min
2、。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法方法一 在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。方法二 取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层
3、，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。（二）Linc- kit+造血干细胞的分离纯化。去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T ,
4、 B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50L细胞悬液 , 加入2.5L CD45- FITC和10L CD34- PE充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450L固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入1
5、00L Fc - R阻滞剂 , 再加入100LCD34 磁珠标记细胞 , 于4冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500L PBS缓冲液重新悬浮细胞。MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500L PBS缓冲液漂洗。以孔径30m的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500L PBS 缓冲液冲洗 3次。 将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中 , 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。重复磁性分离步骤，将洗脱的
6、细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤，用500L PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。二 造血干细胞培养 1 粒-巨噬细胞集落生成单位(GFU-GM)培养（CD34+细胞的培养）采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养。培养体系中含有50g / L重组干细胞生长因子( rhSCF)、10g / Lrh GM-CSF、10g / L重组白细胞介素( rhIL) -3。在1 mL培养体系中加入1105个有细胞。5 %CO2 , 37条件下培养14 d , 倒置显微镜下计数CFU-GM集落数。 2 MNCs与HSCs的体外培养（1） MNCs体外培养：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养 , M
7、NCs以5104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1104个/ mL 接种于24孔板中。细胞均置37，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 3 由MNC制备基质细胞层 取新鲜分离的单个核细胞1106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培养板中,于5%CO2,37饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次,3周后培养孔底铺满了基质细胞,去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用。 4 由CD34+细胞制备基质细胞层取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM)中，加入细胞因子FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1和IL-6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5%CO2，37饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，每孔1ml，继续培养2天备用。
