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1、第一章 简介,一.质谱的发展历史 1906年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪. 1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer) 1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole) 1956年 GC-MS开始联用 1959年 质谱首次用于peptide sequencing 1965年 离子共振质谱出现 1968年 电喷雾离子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform ion
2、 cyclotor resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究,什么是质谱仪?,质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析. 离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化) 主要组成部分: 1.进样部分 2.离子源 3.质量过滤器(分析器) 4.离子检测器,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分 样品板 LC或GC,EI源 FAB源 MALDI源 ESI源,Quadruopole
3、Ion trap Time-of-flight,电子倍增器 闪烁计数器,第二章 质谱仪的组成,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,+,+,+,+,+,+,+,+,+,第一节 进样部分,要求： 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。 方式： 进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,第二节 离子源,A :EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小
4、于6ev)形成离子及部分碎片.,EI的优缺点,优点 1.级的灵敏度 2.有达10万个化合物的数据库可快速检索 3.可根据碎片方式鉴定未知物 4.从碎片离子判定结构,缺点 1.质量范围小 2.有可能汽化前发生解离 3.碎片过多有时看不到分子离子,FBI快速原子/离子轰击离子源 Fast Atom/Ion Bombardment,使用高能量的氙原子Cs+离子或甘油-NH4+集团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化. 基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.,FBI优缺点,优点 1、质量数可以做到70
5、00Da。 2、快速。 3、软电离方式，碎片离子少。 4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。 5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。 6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。,缺点 1、质量数高时灵敏度下降严重。 2、灵敏度比MALDI,ESI低。 3、碎片少，结构信息少。 4、基质多峰，干扰结果分析。 5、样品必须能溶于基质。 6、非极性物质难以离子化。,C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用
6、基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,常用基质结构,DHB,SA,CCA,MALDI的优缺点,优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵敏
7、度。 3、软电离方式，无或极少碎片离子。 4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。 5、适于分析复杂混合物。,缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。 4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低（如 含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。,Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum C
8、oncentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT contain any Azide SDS Brij 35 Tris base CHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100 DMSO Tween DMF Zwittergent Glycerol any other detergent Phosphate buffers Salts and buffers 100 mM,The following components are
9、ACCEPTABLE Acetic or formic acid Acetonitrile, ethanol Guanidine/HCl 4M Hexafluoroisopropanol up to 40% Methanol Sodium chloride 10 mM Urea 1M,D: ESI离子源 Electrospray Ionization,4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一
10、过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷,NANO-ESI喷雾照片,ESI特点,1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,电荷数和质量数的计算,已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-
11、nj =mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,ESI优缺点,优点 1、质量数可达70，000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电离，可观察生物分子非共价反应。 4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。 7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。 8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。 3、样品需先气
12、化，混合物不适用。 4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。 5、定量时需内校准。,E: 其他离子化方式,阳离子化: 以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。 尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这以过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。 阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+. 阴离子化: 分子失去一个质子，带上正电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。,第三章 质量分析器（过滤器）,第一节：质量分析器的主要指标 A、质量范围（/） 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产
13、生响应时，最低的浓度值。,n,D、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,不同分辨率谱图效果,E：分子量的表述方式,1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。 只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。,2、化学平均分子量M 根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。 3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。 表述
14、方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰， m/z 8000时与最高峰质量趋于一至。,第二节 质量分析器的种类,A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率， DC： RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。,DC+RF,四极杆质量分析器的 优点,四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接 1、能容忍相对低的真空度（约10x10Torr） 2、m/z可达3000， ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。 3、开
15、销低廉。,B、离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,环形电极,离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,C、飞行时间质量分析器 Time-of-Flight Analyzer,离子的E=UZ=mv 飞行时间t=,t=const,L,v,m,z,反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS),Uref,TOF对真空度的要求非常高10Torr MALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOF,D、傅立叶回旋共振质量分析器 fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance,质量精度最高，达0。001,几种质量分析器的比较,第三节：质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析 Collision-induced dissociation(CID) Ion source ion daughter ion granddaughter ion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,空间串联质谱仪,A、串联四极杆（三级四极杆） triple-Quadrupole Analyzer Q为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,几种检测方式,1、MS方式： 所有离子通过QQQ到达检测器。 2、M
