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1、蛋白纯化 陈虹亮总结 Sunday, November 25, 20071.我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有5060左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你
2、的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点,这也是个办法。 2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶?我已经给你发了相关一些偶联的材料,请查收,现在一般要自己合成亲和填料,有很多公司都提供活化好的介质,自己偶联就可以,其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,氨基琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖
3、凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,此外也曾经有文献报导固定辅酶时,偶联位置不同,选择性有差别,因此你可以选择自己适合的活化介质。 不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求,所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。 我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以,而且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定,配基脱落少。我觉得是不错的选择。 包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽
4、量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件. 层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。 3)Sephadex G-25(medium)柱脱盐时,盐浓度太高对柱效有影响吗?若有,一般对盐浓度限度如何? 大家别客气,除盐对于浓度应该也是有一定的限制的,同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些,相对需要的柱子的分辨率也要高点,但是在正常的范围如1-2M应该影响不大,不过要除得很干净还
5、是尽量少上点样品,我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。 4)我的蛋白17kd左右,能跟肝素亲和,一般用离子交换和亲和层析纯化, 现在我用聚乙二醇修饰它 ,分子量增加5000左右,修饰率不可能达到100,请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除掉) 他们大多用凝胶过滤,我觉得这也不错的做法,毕竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通蛋白行为不一样,修饰度越高那么出峰也越后,因此你的蛋白选择sephadex G50试试,它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链,修饰后的蛋白疏水性增强,修饰度越高,疏水性越
6、强,可以用这个原理分离。离子交换也可以选择,因为同样道理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理,你可以试试,你手头的亲和能不能分开,你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。 5)我是个新手,谢谢楼主给我解决了许多难题。 我有个问题困绕很久,从细菌中提取酶,好象用常规的方法(超声波破壁,缓冲液提取),总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强,需要加助溶剂才能提取出来?另外,我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取? 其实这个问题我觉得是这样的,既然你是提取那肯定是有沉淀和上清,你的目标蛋白的分子量你是应该知道的,那么跑电泳先看
7、它到底是在上清还是沉淀里,剩下的问题你再解决如何提取。 对于不同的酶要看酶稳定如何,你可以用不同的PH去提取,我曾经提取一个酶用水就是提取不出来,需要用盐才能提取出来,多试试,设计个方案,这样才能解决问题,所以不一定加甘油就管用,你还得注意破碎本身会不会有问题,倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。 6)HPLC是用来分析检测or分离纯化? 如果可以用来纯化,上样量那么小有什么意义呢? 如果是用来分析检测,怎样指导以后的分离纯化工作呢? HPLC既可以做分析也可以做制备,纯化上样量小,这样分离效果好,就可能得到很纯的物质,同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等,这些
8、纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具. 分析出来后如果这个物质很稳定,直接线性放大就可以做大规模的制备,因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。7)利用蔬水性质,用反向HPLC方法分离的原理?(包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等),请chromatography兄详细点。反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的,极性越强先出来,极性越弱越后出,洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱,反像是极性强的流动相吸附,降低它的极性洗脱,选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的
9、都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具. 8)求助,我有一段小分子量的蛋白,5KD左右,4对二硫键,诱导表达后以包涵体形式存在,请问,我怎么设计我的纯化步骤?我用过离子交换柱,纯度可以达到60%,但是不知道下边该怎么做?望赐教!这是我的电泳图谱,第8条泳带的最下
10、边就是我的目的蛋白带,我需要复性,这是一段杀菌蛋白,我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体,BL21表达你好,我做复性不多,你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献,我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的,还有用分子伴侣,你可以多看看再尝试:)至于纯化,如果你的蛋白有游离的巯基,那我觉得很时候用以前的共价层析,专门对于巯基进行纯化,那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料,你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我,我可以把这个材料发给你,如果没有,那你只好用离子交换,凝胶过滤,你的既然抗菌,
11、你知道是什么原理,作用于什么部位,和什么结合,那也许可以用亲和的方法,我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构,你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解,然后降低变性剂的浓度,这样类似分级沉淀,你就可以得到很纯的包涵体,再纯化就容易了,总之我建议你先分级沉淀包涵体,再做纯化。这样省事点。9)我想用一个短肽(5肽)作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白(67kda),用什么填料比较好,您有什么好的见意?谢谢对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂,否则由于位阻很难有很好的分离效果,说到活化填料的选择我多说几句,大多人都会选择溴化氰,但是这样做的介质一般杂吸附多,此外没有亲和手臂,所以对于
12、小分子的配基有时候纯化效果不好,此外本身对介质也没有交联作用,所以刚性也差,如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多,这是它的一些缺点。环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择,刚性也好,没有非特异吸附,形成的键比别的活化方法更稳定,因此合成的亲和介质性能更出色,你可以选择这样的方法,偶联很简单,你pM你的邮件给我,我可以把一些材料发给你,供你参考。10)我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000, 等电点4,目前要去除内毒素有何简单可行的方法?(此蛋白已经纯化好,但检验内毒素不过关)你用过分子筛吗?superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这
13、种方法除内毒素,非常有效。如果问题请与我联系。,我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到10EU/mg11)请问HPLC是在蛋白复性后做比较好,还是在HPLC之后再来复性?复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.12)我想问问:我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗,用什么结合缓冲液和洗脱缓冲
14、液好?我现在拟的是:可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响13)这段在用离子交换柱纯化蛋白,我想问一下,洗脱采用的离子强度的大小范围,应该如何确定,可以根据什么来调整洗脱时的离子强度一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间,怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定,最直接的就是你的目标蛋白,如果在很早就出来,那你洗脱的盐浓度(离子强度)就不用太大,如果出来的很晚或一直没有出来,那就选择更高的盐浓度。当然你也可以选择用阶段洗脱的方法,这样比较容易放大,分离效果其实也不错,虽然摸索要麻烦点,但是重现性好,也一样可以做得很纯,而且能很精
15、确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法14)你好:我有一个困惑了好长时间的问题,想请教。我的蛋白是2KD,在做非还原电泳时,发现除了目的蛋白外,有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%,余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时,只出现两个峰,第一主峰占90%(目的蛋白的位置),出峰时间为13分钟,第二主峰占10%,出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时,二聚体和多聚体是否发生改变?用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度,是否不妥?我用柱子是C4柱,5m,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈,流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系,但是即使如此,那聚合体在反相上能有这么大的差别吗,你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试,或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白,如果第一个峰也是蛋白,那说明你推断是对的,如果不是,那就是没有分开。我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点,非还原电泳也应该不错,反相你可以查查文献有没有这么检测的。目前检测protein aggregation的方法主要有四种。1.gel filt