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1、1,一.概 述,聚合酶链反应（ polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。 数小时达107-108倍 1985年，Centus公司Kary Mullis 发明 1993年因此获诺贝尔化学奖,2,PCR扩增仪,3,引物复性,4,延伸,再变性,5,再复性,再延伸,6,短片段以指数形式扩增 长片段以线性形式扩增 最终主产物片段长度在P1-P2之间,7,PCR循环的主要参数： 1. 预变性：92C-95 C， 2-5min 2. 变性： 92C-95 C，30s-1min 3. 复性： 40 C-60 C，20s-2m
2、in 4. 延伸： 70 C-75 C，30s-3min 5. 总延伸：72 C， 7min,8,三、PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,9,PCR扩增条件,94, 5min 94, 1min 30 55, 1min 72, 1min 72, 7min,10,11,DNA Marker,NGF,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,12,13,14,15,三. PCR反应体系,缓冲液 提供所需的pH环境 DNA模板：欲扩增的DNA样品 dNTP： 四种脱氧核苷酸 MgCl2： 提供Mg+离子 引物： 根据欲扩增的DNA样品设
3、计 耐热的DNA聚合酶： 来源于喜热的细菌,16,耐热的DNA聚合酶,17,1.PCR buffer: 72C 时，反应体系的pH值下降1个单位，接近于7.2 MgCl2 浓度12mmol/L，过量引起非特异扩增，不足使酶活性显著降低，导致产物量少； 2. 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）： 是合成的原料，四种的浓度应相等，浓度一般为50200molL。,18,3.引物： 0.1-1umol/L 高浓度 引物二聚体、非特异产物 低浓度 产率低 4. Taq酶： 来自于水生栖热菌（Thermus aquaticus), 最适反应温度为7075oC。 常用浓度为12.5U/100ul，浓度过高缺乏专一
4、性，过低则产物产量低。,19,5. DNA样品 按照常用的分子生物学方法制备的DAN或RNA样品，其纯度应能达到实验要求。 质量100-500ng 不含有蛋白酶、核酸酶、DNA结合酶、 Taq酶抑制剂 6 .石蜡油 减少反应液的蒸发,20,四.影响PCR的主要因素,1 . 温度参数： 模板变性温度-低温不产生单链DNA模板，PCR不启动；超过95C，影响Taq酶活性 退火温度 温度高-特异性强，引物与模板结合不 牢，DNA扩增效率下降 温度低-产量高，特异性差 Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5,21,引物延伸温度： 取决于Taq酶最适温度 70-75C 大于1Kb的DNA片段，1
5、min以上，并加入明胶或BSA 15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段扩增,22,PCR扩增平台期,循环到一定次数后，扩增产物不再以指数关系增加，而是以线性关系增加或不增加，称为平台期。 提前进入平台期的原因 1.引物量不足 2.dNTP量不足 3.Taq酶失活 4.原始模板数量太多,23,循环次数： 25-35次 次数太多-核苷酸错配、非特异扩增多 进入平台期，增加次数效果不大 次数太少-产率低,24,2.引物设计,引物 与待扩增的DNA序列互补的寡核苷 酸片段。 5引物又称上游引物，其核苷酸序列与模板 5序列相同。 3引物又称下游引物，其核苷酸序列与模板 3序列互补。,25,引物长度,
6、人类基因组有30亿bp，按照统计学的计算，随机组合的17 个碱基的核苷酸序列，在人类基因组中可能出现一次。 引物长度一般为20-24个碱基。有时也见50甚至更多的碱基。,26,引物组成： 碱基随机分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60% 引物内部避免形成次级结构如发卡结构 两个引物之间不应互补，避免形成引物 二聚体,27,两条引物应避免有同源序列，以免两条引物竞争模板的同一位点。 引物5端： 可加上酶切位点或荧光素等 引物3端：5-6个碱基与靶DNA严格配对,28,3 TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATA CGGTAAG5 引物 5 GTGAATTCTCT
7、C AACCGTAT 3 注：红色部分为限制性内切酶切割位点，碱基与 模版链不完全互补。,29,逆转录PCR （Reverse Transcription PCR，RT-PCR） 原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用需要的引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。 应用：分析基因的转录产物；获取目的基因； 合成cDNA探针；,30,选取适当的组织，提取总RNA,以mRNA做模版,加入引物、逆转录酶、dNTP、,合成cDNA的第一链,逆转录酶水解mRNA链,合成cDNA的第二链,加入引物、Taq酶，做常规PCR,扩增出
8、大量的cDNA分子,31,RT-PCR操作需注意的问题： 1.模版RNA应严格纯化，； 2.避免RNA酶污染； 3.所用与实验有关的物品，需用0.1的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。,32,增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经1520个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,33,2
9、. 巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,34,巢式PCR,采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。,P1上,P1下,P2上,P2下,P1上,P2上,35,First round primers,First round PCR,Second round primers,Second round
10、PCR,Gene of interest,36,在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。,3、多重PCR,37,定量PCR 测定靶基因的原始拷贝数 目前常用Taq man法.该法的原理是:反应底物中加入荧光探针,探针中的荧光基团与淬灭基团距离近,荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭,随着反应的进行,结合在靶序列上的荧光探针被Taq酶水解,荧光基团发射的荧光,被监测系统接收。据荧光强度,计算靶基因的原始拷贝数.,38,实时定量PCR技术原理,
