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1、1家兔血浆中北豆根碱的高效液相色谱法测定及药动学研究作者：朱孝芹，臧亚如，张欢，刘翠哲【摘要】目的建立家兔血浆中北豆根碱（RM）的 HPLC 分析方法，并对 RM 静注给药在家兔体内药动学过程进行分析研究。方法采用乙腈、二氯甲烷沉淀蛋白质并提取药物，采用 HPLC 法测定。色谱柱为 DiscoveryC18 柱（4.6mm250mm，5m） ；流动相为乙腈水磷酸=16840.15(VVV)；检测波长 208nm；柱温为室温；流速 0.5mlmin-1；动物实验使用家兔 6 只，采用静脉注射给药（10mgkg-1） ，进行血药浓度测定和药动学参数计算。结果家兔血浆内源物质对药物测定无干扰，在血药
2、浓度 0.010.10mgml-1 范围内，浓度对峰面积有良好的线性关系，r=0.9998，提取回收率大于 85%，方法回收率在 98.3%100.5%之间；日内、日间精密度 RSD 均小于 10%（n=5） 。北豆根碱在家兔体内的血药浓度-时间曲线符合二室模型。结论该法准确、简便、灵敏，可用于北豆根碱在兔体内药动学的研究。【关键词】北豆根总碱；高效液相色谱法；家兔；药动学AbstractObjectiveToestablishanHPLCmethodfordeterminationofdauricineinrabbitsplasmaandstudytherelatedpharmacokine
3、ticsinrabbitsafterinjection.MethodsAfterproteinwasprecipitatedwithacetonitrileanddichloromethane,dauricineinplasmawasdeterminedonHPLCwithUVdetectionat208nm,andthemobilephasewasacetonitrile-water-phosphoricacid(16840.15),runningataflowrateof0.5mlmin-1.Wedetectedtheconcentrationofdauricineinplasmaandc
4、aculatedpharmacokineticparametersby6rabbitsafterinjection(10mgkg-1).ResultsDauricineandendogenouscouldbeseparated.Itscalibrationcurvewaslinear(r=0.9998)withinrangeof0.010.1mgml-1,theextractionrecoverywasmorethan85%,themethodrecoverywaswithinrangeof98.3%100.5%,theintra-dayandinter-dayprecisionwasless
5、than10%(n=5).Theconcentration-timecurveofdauricineinrabbitsplasmacouldbefittedtotwo-compartmentmodel.ConclusionThismethodissensitive,simpleandaccurate.Itissuitableforthepharmacokineticstudyofdauricineinrabbits.KeywordsDauricine;HPLC;Rabbits;Pharmacokinetics北豆根为防己科植物蝙蝠葛 MenispermumdauricumDC.的干燥根茎，有清
6、热解毒、祛风止痛作用，其有效部位是生物碱，现已知北豆根中含有近二十种生物碱，总碱含量可达 1%以上，其中含量最高的生物碱为 RM，其含量约占总生物碱的 50%左右1 。临床及实验均证实 RM 有良好的抗心律失常作用，且 RM 延长心2肌动作电位时程作用存在剂量依赖性2 。此外，北豆根碱还有抑制动脉血栓形成3 、抗氧化4 、抗肿瘤等5作用，具有广泛的应用前景。本实验采用单剂量静脉注射给药的方法，检测北豆根碱在家兔体内的血药浓度，应用 3p87软件计算药动学参数。1 仪器与试药80-2B 型台式离心机；802B 型台式离心机；LG16W 型离心机；ZH-2 型全自动涡流混合器；JASCO 高效液相
7、色谱仪（UV-15 紫外-可见光检测器，RU1580泵，CKChom 色谱工作站，日本） ；北豆根饮片，市售，承德产，经鉴定为蝙蝠葛；北豆根碱，对照品，自制（含量 99.0%） ；无水甲醇、磷酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为 DiscoveryC18 柱（4.6mm250mm，5m） ；流动相为乙腈水磷酸=16840.15(VVV)；检测波长 208nm；柱温为室温；流速 0.5mlmin-1。2.2 对照品储备液精密称取北豆根碱对照品(60干燥至恒重)5.0mg 置 25ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品储备液。2.3 样品处理方法6精密吸取家
8、兔血浆 1ml，加乙腈 0.5ml，二氯甲烷 4ml，旋涡混合5min，3000rmin-1 离心 15min，将有机相转入 10ml 离心管中，剩余水相再加入二氯甲烷 2ml，同法萃取并离心，合并 2 次萃取液，40水浴，N2 吹干，残渣用流动相 0.2ml 定容，充分溶解后，16000rmin-1 离心 5min，取上清液 20l进样。2.4 标准曲线的制备取空白血浆 1ml 置离心管中，加入北豆根碱对照品溶液，使其浓度分别为 0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，0.10mgml-1，按“样品处理方法”项下操作，以 RM 峰面积对 RM 血药浓度进行回归，其回归方程
9、为：Y=1.53108X+1.8103，r=0.9998(n=7)，线性范围为 0.010.1mgml-1。血浆样品典型色谱图见图 13。2.5 回收率测定分别取空白血浆 1ml，准确加入北豆根碱对照品溶液，配制高中低 3 个浓度的血浆样品，按“样品处理方法”项下操作，使其最终浓度为0.01，0.06，0.1mgml-1，同时配制相同浓度的北豆根碱对照品水溶液进行测定，每个浓度测定 5 次。计算提取和方法回收率。结果见表 1。表 1RM 血浆样品3回收率壹（略）2.6 精密度测定将高、中、低浓度的对照品血浆分别进行日内精密度和日间精密度测定。结果见表 2。表 2RM 血浆样品的日内和日间精密度
10、（略）2.7 家兔血浆样品测定健康家兔 6 只，雌雄兼用，雌兔无孕，体重(1.60.24)kg，于耳缘静脉注射给予北豆根碱，剂量为 10mgkg-1。于给药前和给药后 2，5，10，20，30，45，60min 及 1.5，2，4，6，8，12h 在另一侧耳缘静脉采血 2.5ml,置肝素化离心管中，3000rmin-1 离心 15min，分离血浆，-40贮存备用。血浆样品照“2.3”项下处理，测定。将实验结果绘制血药浓度-时间曲线如图 4 所示。应用 3p87 软件进行模型拟和。以 AIC 和拟和优度（r）为判别指标，确定血药浓度为二室模型。结果 RM 在家兔体内过程符合二室模型，其相关药动学
11、参数见表 3。表 3 药动学参数（略）3 讨论家兔静脉注射 10mgkg-1 北豆根碱后，药物自中央室向周边室分布很快，T1/2 约为 5min，药物从中央室消除也较快，T1/2 约为 1h，Vd 值大于实际的体液体积，说明北豆根碱因脂溶性强而在体内广泛分布。有文献报道78 ，北豆根碱口服给药，在大鼠和狗体内存在着胃肠循环，C-T 曲线明显存在着双峰现象。狗大剂量(50mgkg-1)口服给药时，药物消除为非线性，T1/2，CL，AUC 等重要参数显著改变。但由于种属差异的问题，在兔体内是否也存在这一现象，尚需进一步研究。在本实验中，从高效液相色谱图上可以看出，在给定的实验条件下，血浆中杂质不干
12、扰测定，说明本实验的样品处理方和色谱条件可行，通过 3p87 药动学软件处理数据，北豆根碱在家兔体内符合二室模型，可做为人体药动学研究的参考。【参考文献】1徐国钧，徐珞珊，何宏贤，等中国药材学M.北京：中国医药科技出版社，1996.2GuoDL,ZengFD,HuCJ.EffectsofDauricine,quinidine,andsotlotonactionpotentialdurationofpapillarymusclesinvitroJ.ActaPharmacolSin，1997，18：384.3刘俊田，邱培伦，高小利山豆根碱对实验性血栓形成的影响J.西安医科大学学报，1991，12(1)：33.4何丽娅，李立中，吴基良，等.蝙蝠葛碱的抗氧化研究J.中草药，1997，28（8）：479.45叶祖光，王金华，孙爱续，等粉防已碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱增强长春新碱诱导人乳腺癌 MCF-7 多药耐药细胞凋亡J.药学学报，2001，36（2）：96.6顾世芬，师少军，陈汇蝙蝠葛苏林碱在兔血浆浓度检测及药代动力学J.药学学报，2003；38（12）：908.7陈淑娟，张斌，杨毅梅蝙蝠葛碱在犬体内药代动力学研究J.中国临床药理学与治疗学，2005，5（3）：213.8陈淑娟，杨毅梅，刘亦明蝙蝠葛碱大鼠体内药代动力学研究J.中国药理学通报，2001，17（2）：225.
