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1、SDS-PAGE标准操作规程一、 试剂（一）储存液(1) 2M Tris-HCl (pH8.8)，100ml称取24.2g Tris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH8.8(约加4ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml。(2) 1M Tris-HCl(pH6.8)，100ml称取12.1g Tris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH6.8(约加8ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml。(3) 10%(w/v)SDS，100ml。室温保存称取10g的SDS；加蒸馏水至总量为100ml。(4) 50%(v/v)甘油，100ml倒取50ml
2、 100%的甘油；加入50ml蒸馏水。(5) 1%(w/v)溴酚蓝，10ml称取100mg溴酚蓝；加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。（二）工作液(1) 30%(w/v)丙烯酰胺/0.8%(w/v)双丙烯酰胺30g丙烯酰胺0.8g双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45m滤膜。可在4存放数月。(2) 4Tris-Cl/SDS (pH8.8 1.5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS) 91g Tris base2g SDS 加水300ml
3、，用1N HCl调pH至8.8，再加水至500ml过0.45m滤膜，4存放(3) 4Tris-Cl/SDS (pH6.8 0.5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS)6.05g Tris base0.4g SDS 加水40ml，用1N HCl调pH至6.8，再加水至100ml过0.45m滤膜，4存放(4) 10%过硫酸铵APS0.1g过硫酸铵1ml蒸馏水长期不用应-20干燥分装保存，临用前再加D.W。(5) 5电泳缓冲液15.1g Tris碱 72.0g甘氨酸 5.0g SDS 加蒸馏水至1L，pH应该在8.3左右。(6) 5样品缓冲液，10ml0.6ml 1mol/L的T
4、ris-HCl(pH6.8) 60mmol/L5ml 50%的甘油 25%2ml 10%的SDS 2%0.5ml 2-巯基乙醇 14.4mmol/L1ml 1%溴酚蓝 0.1%0.9ml的蒸馏水可在4保存数周，或在-20保存数月。(7) 考马斯亮兰染色液1.0g R-250450ml甲醇450ml D.W100ml冰醋酸(8) 脱色液100ml甲醇100ml冰醋酸800ml D.W(9)二、 步骤1. 准备先将电泳玻璃平板洗干净，用95%乙醇擦净，晾干，固定于平板固定架上。（注意：高低板方向正确，底面要平，必要时可用凡士林封底；玻璃平板固定高低时四个螺丝应依次适当旋紧，再装于固定器架）2. 制
5、胶按如下顺序配制和添加试剂stacking gelseparating gelT=4% C=2.6%10%12%13%D.W6.17 ml4.17 ml3.5 ml3.17ml30%Acry/0.8%Bis1.33 ml3.33 ml4.0 ml4.33 ml4Tris-Cl/SDS (pH8.8)2.5 ml2.5 ml2.5 ml4Tris-Cl/SDS (pH6.8)2.5 mlTemed57l(一般6)57l7.5lAp(10%)5070l(一般60)5070l75l注意：配胶时勿搅起气泡，先配好其它成分，在灌胶前用枪头分别吸好适量TEMED和AP后，再先加TEMED摇匀，后加AP，摇
6、匀后灌胶。3. 灌胶 插入梳子使梳子凹孔略低于低的平板，略低于梳子底沿处划好高度线，拿去梳子，Seperating gel从一固定位置（中部）快速倒入平板内至划线处，再吸取约1ml D.W缓缓注在Seperating gel面上（起压平胶面作用），静置约50mins待胶凝结； 倒出D.W，亦可再用滤纸小心地将残余水分吸干，插入梳子，沿一侧缓缓注入适量的Stacking gel（勿产生气泡），静置约20mins（其间可加入少量SDS电泳buffer防止蒸干）； 移去梳子出现几个样品槽，用电泳buffer冲洗样品槽2遍。4. 平板等装入电泳槽，加入电泳buffer淹没低板5. 加样将样品用适量的样
7、品buffer稀释后煮沸三分钟，再小心地将样品加入电泳凝胶槽中，加样时不能用气泡。上样量要根据凝胶槽大小而定，过多会溢出到相邻孔而影响结果。6. 走胶（约45mins-1hr）先低电压70V 20mA，待样品进入分离胶后再调高电压约140V 40mA直至指示色带到达平板底端，停止电泳关闭电源。7. 染色脱色倒去电泳buffer，自来水冲洗，取下凝胶，用考马斯亮兰染色，染色5-10min，脱色1hr左右。三、 注意事项1. 检查电极不要插反，开始电泳后要观察电极丝附近是否有气泡冒出，从而确认电流正常。2. 过硫酸铵最好现配现用，若要留存一星期，必须冻于-203. TEMED和丙烯酰胺是神经毒，操作时要小心。
