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1、PCR聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑.PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断.癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期和良性的阶段就可
2、出现.PCR技术不但能有效的检测基因的突变,而且能准确检测癌基因的表达量,可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断.PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和-地中海贫血的基因突变开始的.基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡,用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异,是地中海贫血诊断的有效手段.PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下
3、轮反应作准备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.PCR的应用在基因诊断和肿瘤标志物检测两大领域.关于名称
4、根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcriptionqPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少数作者并没有坚持这一原则。 根据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。现将其原理
5、简述如下：1. TaqMan荧光探针：TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的35外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又
6、可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是：1 开始反应，当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光；2 DNA变性时，SYBR染料释放出来，荧光急剧减少；3 在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR引物；4 聚合完成后，S
7、YBR染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。实时荧光定量 PCR 技术根据化学原理可以分为探针类和非探针类。探针类实时荧光定量 PCR 技术主要是利用与靶序列特异杂 交的探针来指示扩增产物的增加；非探针类实时荧光定量 PCR 技 术主要通过荧光染料来指示产物的增加。无论是探针类实时荧光 定量 PCR 技术还是非探针类实时荧光定量 PCR 技术，检测的都是 扩增产物的增加量。但探针类实时荧光定量 PCR 技术增加了识别 探针的具体的流程，操作的难度较大。实时荧光定量 PCR 技术的特点1 准确性高 实时荧光定量 PCR 技术使用专门针对靶序 列设计的特异性来识别定量分子，准确
8、度很高，由靶序列和探针 双方面控制，大大提升了 PCR 技术的特异性，降低了检测的假阳 性率。2 灵敏度高 实时荧光定量 PCR 技术将传统的 PCR 技 术、荧光标记技术和激光技术进行了融合，提高了检测的灵敏性。3 线性反映好 由于荧光信号和扩增产物具有一定的联 系，因此，使用实时荧光定量 PCR 技术可通过检测荧光信号定量 扩增产物。4 易操作、环保性高 使用实时荧光定量 PCR 技术进行 检测是在一个管内完成的，可减少相关污染物的排放，检测可在 一次完成，无需进行反复的检测，不会出现反复污染的情况。5 速度快、效率高 使用实时荧光定量 PCR 技术可在 2 3 个小时完成多个样品的定量分析，有效地减少医务工作者 的劳动量。
