lc-ms联用原理及应用

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1、液相色谱液相色谱质谱联用的原理及应用质谱联用的原理及应用 简介 1977 年，LC/MS 开始投放市场 1978 年，LC/MS 首次用于生物样品分析 1989 年，LC/MS/MS 取得成功 1991 年，API LC/MS 用于药物开发 1997 年，LC/MS/MS 用于药物动力学高通量筛选 2002 年美国质谱协会统计的药物色谱分析各种不同方法所占的比例。1990 年，HPLC 高达 85%，而 2000 年下降到 15%，相反，LC/MS 所占的份额从 3%提高到大约 80%。我们国家目 前在这方面可能相当于美国 1990 年的水平。为此我们还有很长的一段路要走色谱质谱的在 线联用将

2、色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来， 实现对复杂混合物更准确的定量和定 性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。 色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质 联用互为补充，分析不同性质的化合物。 液质联用与气质联用的区别: 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化 的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的 分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多

3、肽、多聚物等） 的 分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。 现代有机和生物质谱进展 在 20 世纪 80 及 90 年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量 500Da 以下的小分子化合物。20 世纪 70 年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定 分子量高达 15002000Da 的非挥发性化合物，但重复性差。20 世纪 80 年代初发明了快原子 质谱法（FAB-MS） ，能够分析分子量达数千的多肽。 随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质 谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（M

4、ALDI-MS）应运而生。 目前的有机质谱和生物质谱仪，除了 GC-MS 的 EI 和 CI 源，离子化方式有大气压电离（API） （包括大气压电喷雾电离 ESI、大气压化学电离 APCI、大气压光电离 APPI）与基质辅助激光 解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称 API-MS。后者常用飞行时间作为 质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。 API-MS 的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药 物代谢、 临床和法医学、 环境分析、 食品检验、 组合化学、 有机化学的应用等； MALDI-TOF

5、-MS 的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。 质谱原理简介： 质谱分析是先将物质离子化， 按离子的质荷比分离， 然后测量各种离子谱峰的强度而实现分 析目的的一种分析方法。 以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标， 离子质荷比为横坐标所 作的条状图就是我们常见的质谱图。 常见术语: 质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作 m/Z. 峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度. 基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰. 总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子

6、；多电荷离子；同位素离子 总离子流图: 在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC 图. 质量色谱图 指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图. 利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是 LC/MS 测定中最有用 的方式。当样品浓度很低时 LC/MS 的 TIC 上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息， 输入 M+1 或 M+23 等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在 LC/MS 上都能反映出来，确定 LC 条件是否合适，以后进行 MRM 等其他扫描方式的测定时 可作为参考。 1.0 指与分子存在简单

7、关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是 M+H+ 或M-H- . 在 ESI 中, 往往生成质量大于分子量的离子如 M+1,M+23,M+39,M+18称准分子离子,表示 为:M+H+,M+Na+等碎片离子： 准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子. 碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表 示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。 Ephedrine, MW = 165 多电荷离子： 指带有 2 个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝 大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-

8、如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的 存在说明样品是较稳定的.采用电喷雾的离子化技术, 可产生带很多电荷的离子,最后经计 算机自动换算成单 质/荷比离子。 同位素离子 由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子. 各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合 物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物, 再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结 构,反应历程等 如何看质谱图： (1)确定分子离子,即确定分子量 氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的

9、分子，其质量数是奇 数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在 38 和 1013，2125 之间均不可能， 则说明是碎片或杂质。 (2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式 高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式 低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例: (3)峰强度与结构的关系 丰度大反映离子结构稳定 在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力 越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。 不同类型有机物有不同的裂解方式 相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异需要经验记忆。 质谱解析的一

10、般步骤 (适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好) (1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当 (2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据 等. (3) 尽可能判断出分子离子。 (4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如 M-1， M-15，M-18，M-20，M-31意味着失 H，CH3，H2O，HF，OCH3 (5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对 比。 有机质谱的特点 优点: (1)定分子量准确，其它技术无法比。 (2)灵

11、敏度高，常规 10-710-8g,单离子检测可达 10-12g。 (3)快速，几分甚至几秒。 (4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS 对于难分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。 (5)多功能，广泛适用于各类化合物。 局限性: (1)异构体，立体化学方面区分能力差。 (2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场 NMR，IR 等自己动手，须专人操作。 (3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。 (4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。 质谱仪器： 质谱仪由以下几部分组成 数据及供电系统 进样系统离子源质量分析器检测接收器 真空系统 真空系统 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在

12、高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免 发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用 液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。 由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分 析器部分的真空。 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。 进样系统 把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC 及接口，加热进样，参考物进样 等。 离子源 使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析 器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常

13、用的有如下几种，其中 EI，ESI 最常用。 EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。 CI(Chemical Ionization):化学电离核心是质子转移。 FD(Field Desorption):场解吸目前基本被 FAB 取代。 FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。 ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析 小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等) APCI(Atmospheric Pressure

14、Chemical Ionization):大气压化学电离同上， 更适宜做弱极性小分 子。 APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性 分子。 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和 FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子 其中 ESI，APCI，APPI 统称大气压电离(API) 实验室现有的离子源: ESI 电喷雾电离源 APCI 大气压化学电离源 电喷雾（ESI）的特点 通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或

15、M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由 于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物 大分子。 电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定 热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和 DNA 等生物大分子； 通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内 CID）测定化合物结构。 大气压化学电离（APCI）特点 大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于 2000Da 的弱极性 的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压 控制离子的碎裂。 电

16、喷雾与大气压化学电离的比较 电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而 APCI 电离是高压放电发生了质子转移而生成MH+ 或M-H-离子。 样品流速：APCI 源可从 0.2 到 2 mlmin；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为 0.2-1 ml min. 断裂程度；APCI 源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解. 灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合 物，而 APCI 更适合于分析极性较小的化合物。 多电荷：APCI 源不能生成一系列多电荷离子 NanoSpray 离子源 专门设计的NanoSpray 离子源特别适合于做微量的生化样品， 其流速范围可从5nLmin 到 luLmin。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。 灵 敏度可高达 fmole。并可直接与微孔 HPLC 联用。 正负离子模式: 一般的商品仪器中,ESI 和 APCI 接口都有正负离子测定模式