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1、Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅(生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系操作说明本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。1.制作标准曲
2、线a.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；b.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔；c.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后每100L培养基加10L CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。2.细胞活性检测a.在96孔板中接种细胞悬液(100L/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；b.向每孔加入10L的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)；c.将培养板置于培养箱内孵育
3、1-4小时；d.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。3.细胞增殖-毒性检测a.在96孔板中接种细胞悬液(100L/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；b.向培养板加入不同浓度的待测药物；c.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；d.向每孔加入10L的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)；e.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；f.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。保存条件4C一年-20C两年长期保存，建议避光注意事项1.CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8的*佳反应时间以具体显色的*佳时间为准。2
4、.使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈*容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。4.加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话，将会100%
5、抑制。5.培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。6.本产品可以检测，但不能检测酵母细胞。向100L培养液中加入10L CCK-8溶液，并培养1-4小时或过夜。7.CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加(注:活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。8.要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。9.建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。10.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板)：(a).在显色反应后，将培养板放置4C冰箱内(b).每孔加10L 0.1 M HCl溶液(c).每孔加10L 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液注意：反应停止后，应在24小时内测定。11.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。12.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
