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1、金开瑞新一代基因合成开创者,引物合成及常见问题解析,刘振新,引物合成介绍,目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的，相邻的核苷酸通过35磷酸二酯键连接。DNA合成仪有很多种, 但无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。我们公司目前用的是Dr.oligo192高通量引物合成仪。就具有合成质量稳定、一次性合成量大、时间短等优点,2019/7/17,引物合
2、成过程,第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基； 第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸
3、上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 目前引物的氨解一般都是通过氨水高温处理，将连接在CPG上的引物切下来，在经脱盐纯化得到成品。这种方法在纯化的过程中有可能会造成个别引物无法回收，而我们目前采用的是正丁胺氨解，在纯化时可以避免这个问题，不会经常因无法回收而使引物重合造成发货拖延的情况,引物的纯化方式及选择,一、RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一
4、种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。国内主要是金斯瑞采用此类纯化方法。 二、OPC纯化 采用寡核苷酸纯化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge，OPC)纯化，制品纯度保证80 90%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。目前华大、捷瑞使用该方法。,引物的纯化方式及选
5、择,三、DSL纯化 又称为简易反相柱，对DNA有特异性吸附，可被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，因此能有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。目前金唯智使用该方法 其实以上三种方式都是脱盐纯化方式，都是可以有效的去除盐分，但不能去除短片段。下面介绍的两种纯化方式是目前常用的去除小片段的，不过目前客户需要的普通引物，脱盐纯化都可以满足客户的需求,引物的纯化方式及选择,四、PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是
6、一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。主要用于诊断PCR扩增 五、HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高， 以上引物纯化方式我们都可以提供,2019/7/17,最长可以合成多长的引物？,引物越长，出现问题的概率就越大。目前能合成的最长引物为120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百
7、分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。,引物发货时间,一、 15-60碱基脱盐引物24小时能都可以发货，PAGE引物48小时内发货，HPLC引物需要3个工作日 二、大于60个碱基的PAGE引物需要3-5个工作日 三、标记引物需要3-5个工作日,引物的OD数,OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测的引物吸收掉的光密度。引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据
8、稀释倍数换算出母液的OD值。,OD值如何换算浓度？,1.OD值如何转化为物质的量（nmole) 粗略地计算：1个OD值的Oligo 的重量约为33 g，而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此， 合成DNA/RNA的nmol数一般按以下公式 Nmole=（OD*33/碱基数*330）*1000=(OD*100)/碱基数 精确计算： Nmole=(OD*1000)/(15.2*#A)+( 7.4*#C)+ （11.5*#G)+ (8.3*#T),如何计算引物的Tm值？,引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为25mer以下的引物，Tm计算
9、公式为：Tm = 4(G + C)+ 2(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size,2019/7/17,如果测序发现突变，该如何处理？,遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆
10、突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。,2019/7/17,引物质量好坏的判断标准是什么？,合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。所以不要怕客户以扩增不出来来抱怨我们的引物质量,2019/7/17,PCR扩增不出就引物有问题吗？,基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。 引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。,2019/7/17,结束,谢谢！,
