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1、第四章基因工程的主要技术及其原理,第一节DNA和RNA的提取与纯化,制备纯的高分子量的DNA 是基因工程操作的基础之一,一、DNA提取的基本原理与方法,化学性质,比较稳定,潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接。它的碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。,1. DNA的性质：,核苷,核苷酸,碱基,高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基堆积力和DNA骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得黏滞。 由吸液，振荡，搅拌所导致的水流对黏滞的盘绕物产生拖拉力，能切断DN
2、A的双链。DNA分子越长，断裂所需的力越弱。因此，基因组DNA容易成片段地获得，所需分子质量越大，获得的难度也相应增加。,物理性质,2. 天然DNA的来源和用途,天然DNA包括染色体DNA,病毒DNA(噬菌体DNA),质粒DNA,线粒体及叶绿体DNA等,可从不同的生物体中提取.,染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA. 其分子巨大,可长达106kb,小的也有1000kb左右.是生物界含量最丰富的DNA资源,蕴藏着地球上极大部分的遗传信息. 是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料,也可提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统之用.,病毒和噬菌体DNA. 含DNA的病毒和噬菌体的种类
3、很多,能在相应的原核生物和真核生物宿主细胞内大量增殖.由于此类DNA可被体外包装,所以主要用于构建基因克隆载体,承载较大片段的外源DNA,经体外包装,导入受体细胞.此类DNA也编码一些结构基因,可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料.,质粒DNA 很多微生物细胞内含有质粒DNA,游离于细胞质中,所以被称为染色体外遗传物质.每种质粒都有复制起始位点,能自我复制.主要用于构建载体.也要用于分离目的基因和基因表达调控因子.,线粒体和叶绿体DNA. 真核生物特有的染色体外遗传物质,分别含有与呼吸作用和光合作用有关的基因.可用于分离目的基因及构建载体,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提
4、取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法， 以获得可用的DNA大分子。,（一）DNA提取的基本原理DNA分子是极性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离太更易溶于水。酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。生物细胞中大部分DNA集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响，0.14 mol/L NaCl溶液中最低，仅为水中溶解度的1%，浓度升高，溶解度增加，到1 mol/L时，比纯水高2倍。而
5、核糖核蛋白(RNP)在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14 mol/L NaCl的溶解度较大。据此，可分享DNP和RNP.,一般DNA提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及溶解DNA，接着采用几种化学和酶学方法中的任一种， 以去除蛋白、RNA及其它的大分子。,1生物材料的准备 选用的材料应该是处于提取DNA得率最高的生长期,或者是DNA容易提取和含量高的组织.对于细菌,一般取对数生长后期.对于植物一般取幼嫩的植株,并且暗培养1-2天,甚至黄化苗.提取动物肝脏DNA应清除胆囊,因其含有多种高活性酶.,2细胞的裂解和DNA的溶解细胞不裂解,则DNA释放不出来.裂解不完全,得率就低.如
6、果细胞裂解过于激烈,会导致DNA的断裂.裂解方法因物种而异.对于原核生物,可用溶菌酶处理.用NaOH,SDS,用煮沸及冰冻,超声波处理等方法使细胞裂解.,对结构复杂的动植物材料要进行磨样(粉碎)。一般方法是将材料放入研钵（放在冰中预冷），加入液氮，快速磨碎成粉状。然后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞.一般用SDS、CTAB、溶菌酶和蛋白酶K来裂解细胞。所用缓冲液一般为TE（TrisC-HCl EDTA）缓冲液。提取缓冲液：100mmol/L Tris Cl(pH8.0),50mmol/L EDTA (pH8.0),500mmol/L NaCl,10mmol/L 巯基乙醇。在提取时，将10S
7、DS加入缓冲液中于65预热一定时间。然后加入到装有样品的离心管中，于65保温6090min。其间轻轻摇动数次。4下12000rpm离心10min,将上清转入另一离心管中,上清即为DNA的粗提物。,正常条件下，由于细胞的区室化隔离，DNA酶，氧化酶等分布于特定区隔中，不与DNA接触。细胞破碎，则容易导致DA N降解。因此提取过程中对DNA 的保护显得非常重要。措施：（）利用液氮超低温下研磨，减少损失。（）快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。加入EDTA和抗氧化剂及PVP等,3核酸的纯化主要根据核酸的性质,使其与细胞内其它成分分离开来,从中进一步抽提DNA.（杂质的去除）核酸通过
8、有机溶剂抽提并进行纯化。污染的RNA通过RNase消化清除。在粗提物中加入等体积的氯仿异戊醇（或酚氯仿异戊醇）轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min，上清液为DNA的水溶液，根据需要，还可以重复这一步或用氯仿/异戊醇颠倒混匀再离心.此过程目的是用酚和氯仿去除蛋白质。,在提取DNA时有机溶剂的使用,酚和氯仿为非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚和氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。,作为表面变性的酚
9、和氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊. 酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合使用。,在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为24：1
10、，也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24：1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,酚的平衡和饱和酚的饱和： 因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其在抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris 调节其PH值到8.0称为酚的平衡，其原因是DNA分子在此条件下，比较稳定。,4 沉淀DNA 用无水乙醇（异丙醇）沉淀DNA， 这是实验中最常用的方法。具体方法是将上面所提的上清液加入2倍体积的无水乙醇和0.2-0.4 mol/L的NaCl，颠倒
11、混匀，冰冻30min. 可以观察到絮状的沉淀,即为DNA，经离心，除去上清液。 DNA溶液是DNA以水合状态存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。也可改用95乙醇来替代无水乙醇（价格考虑）。,在PH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCL,使Na离子中和DNA分子上的负电荷, 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力, 易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐
12、溶液浓度太高时，其效果也不好，因为过多的盐杂质杂在，影响DNA的酶切等后续反应。,5 DNA的溶解和贮存回收的DNA沉淀在溶解以前须在实验台上敞口放置一段时间，使残余的乙醇挥发掉（或真空抽干），然后加入适当体积的TE缓冲液，使DNA溶解。DNA的TE溶液贮存于超低温冰箱（长时间）或20冰箱。,(二 )DNA提取的几种方法根据细胞破碎后，分离DNA 与蛋白质所采用的技术策略不同，可分为以下几种：1浓盐法原理：RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，从而分离。方法：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP黏液中加入含有少量辛醇的氯仿一起揺荡，使之乳化，再离心，使蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而
13、DNA 位于上层水相中。回收水相，用2倍体积95% 乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。,2.SDS法细胞破碎后，加入SDS使细胞膜裂解，并同时使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA 分开，加入乙酸钾，可使SDS-蛋白质复合物转变成溶解度更小的钾盐形式，沉淀更加完全。3.CTAB法细胞破碎后，加入CTAB分离缓冲液，将DNA 溶解出来再经氯仿异戊醇抽提，除去蛋白，得到DNA,4.苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA 酶的降解作用。苯酚处理后，蛋白质分子溶于酚相，而DNA 溶于水相，离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并水相，用乙醇沉淀DNA.5.水抽提法利用核酸溶解于水的性质，将组织
14、细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中，使DNA 充分溶解于水中，离心后收集上清液，在上清中加入NaCl调节至2.6 mol/L，加入2倍体积的95%乙醇，立即用搅拌法搅出，然后用不同浓度的乙醇洗涤。空气干燥。,有多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，无一例外都包括以下三个步骤：培养细菌 氯霉素的加入收集和裂解离心寄主细胞裂解：可采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱处理及加热处理等。根据质粒大小、菌株和裂解后用于纯化质粒DNA的技术，采用不同的方法。用溶菌酶或十二烷基硫酸钠（）,(三）质粒的提取,质粒的提取是基因工程研究中经常性的工作。,纯化质粒DNA染色体分子以高分子量的形式释
15、放，可用高速度心方法除去得到清裂解液。但仍然会含有相当数量的片段化的染色体分子。因此必须进行纯化。,铯是55号元素，由Wihelm Bunsen于1855年发现。由于铯原子很重，CsCl的浓缩液在高速离心数小时后即可形成密度梯度。大分子物质的浮力密度如与密度梯度中某一位置的CsCl浓度相符，大分子物质就会准确地漂浮在这一位置上.离心管中CsCl起始溶液的密度通常要进行调整,使其与有待研究的分子或颗粒的密度相对应。如多数双链线状DNA分子的浮力密度约为1.70g/ml,形成梯度的CsCl溶液的起始密度应为1.70g/ml,1氯化铯密度梯度离心法,细胞裂解及分离过程中，大分子量的细菌染色体容易发生
16、断裂形成相应的线性片段，而质粒则由于其分子量较少，结构紧密，所以仍保持完整状态。根据此差别进行密度梯度离心纯化。,利用在浓缩的盐溶液中，溴化乙锭（EB)扁平分子在碱基对之间的嵌入作用。 染色体分子线性片段具有游离的末端而易于解旋，可结合大量的EB分子。而质粒的共价闭合环状的分子，由于没有游离末端，只能发生有限的解旋反应，结合分子的数量少。分子结合数量越多，则密度越小。密度梯度离心后，处于不同的位置，从而达到纯化质粒之目的。,2碱变性抽提法 染色体DNA为线性DNA分子，质粒DNA为超螺旋共价闭合环状DNA. 根据共价闭合环状质粒与线性染色体片段之间在拓扑学的差异而发展出来的。 通过加热，尤其在pH值介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性的会被变性，而cccDNA则不会变性。 即根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,
