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1、/白血病相关融合基因的检测及意义白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病
2、的分子生物学特异性标志。白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RAR、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBF-MYH11等。BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基
3、因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年ORiordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley发现缺失下来的
4、那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性
5、，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳
6、性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制剂（TKI）伊马替尼就是是通过结合抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶结构域来抑制其在细胞周期中的影响，从而发挥抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼和尼洛替尼也是在这个基础上进行改进，以以减少因伊马替尼使用而带来的抗药性。对费城染色体和BCR-ABL融合基因的检测，对于正确区分CML类型，指导临床治疗和判断预后情况具有重要的指导作用。RUNX1（Runt-related tra
7、nscription factor 1）基因也被称为AML1（acute myeloid leukemia 1）基因或 CBFA2（core-binding factor subunit alpha-2）基因，RUNX1基因编码的RUNX1蛋白是调控造血干细胞分化为成熟血细胞的转录因子，是RUNX（Runt-related transcription factor）家族或CBF（core binding factor-）的成员，能够与CBF蛋白形成异质二聚体复合物，增强DNA结合和复合物的稳定性。人的RUNX1基因全长260kb，在21号染色体（21q22.12）上，有两个选择性转录启动子，能
8、够通过选择性剪接形成多种转录异构体。全长的RUNX1蛋白由12个外显子编码形成，在这些外显子中，包含有两个结构域，分别被命名为RHD（runt homology domain）和TAD（transactivations domain），前者由2,、3、4号外显子编码形成，后者由6号外显子编码形成。RUNX1蛋白分别通过这些结构域来介导DNA结合和蛋白间相互作用。RUNX1的转录过程受两个增强子的调节，这些组织特异性的增强子能够结合淋系或红系调控蛋白，促进RUNX1基因在造血系统中的高度活化。RUNX1在胚胎发育的造血过程中发挥着至关重要的作用，在所有的造血部位都有表达，能促进造血干细胞和造血祖
9、细胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通过结合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受体c-Mpl的启动子，募集转录活化子或抑制子，进而促进造血干细胞的生成或向其他造血细胞方向分化。RUNX1还能够通过上调Smad6的表达来促进蛋白体降解。ETO基因又称RUNX1T1基因，编码的蛋白是一种锌指结构转录因子和癌蛋白。AML1-ETO融合基因主要见于急性髓系白血病（AML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色体易位导致21号染色体的原癌基因AML1基因和8号染色体的ETO基因融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通过聚合酶链式反应（PCR）检
10、测到，一般被认为其表达量极低或由于降解导致表达不稳定。AML1-ETO融合基因表达的蛋白全长含有752个氨基酸，其N端为RUNX1（runt-related transcription factor 1），也称AML1区；C端是8号染色体编码的RUNX1T1runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)，也称ETO。AML1-ETO融合基因主要发生在M2型AML患者中（约40%），在M2b的阳性率达90%，因而可以作为M2b分型诊断的重要分子标志，少见于M4和M1，极少数骨髓增生异常综合症（m
11、yelodysplastic syndrome, MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。临床上将AML1-ETO融合基因作为分子分型诊断和预后观察的一个重要依据，AML1-ETO融合基因阳性的患者预后较好。AML1-ETO阳性的白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化为较成熟的嗜中性粒细胞核嗜酸性粒细胞，对化疗反应较为敏感，因而AML1-ETO融合基因阳性的患者采用大剂量的阿糖胞苷治疗，完全缓解率高达98%，5年存活率达到67%，预后较除M3外的其他亚型好。因而对初诊患者的AML1-ETO融合基因检测，对预后判断和治疗方案的制定具有重要意义。PML（Promyelocytic leu
12、kemia）基因编码的PML蛋白，属于TRIM（tripartite motif）家族的成员，定位在核小体上，具有转录因子和肿瘤抑制蛋白的功能。PML的表达与细胞周期有关，能够调节p53对致癌信号的反应。RAR（Retinoic acid receptor alpha，维甲酸受体）也叫NR1B1（nuclear receptor subfamily 1， group B， member 1）基因，能编码细胞核受体蛋白。维甲酸信号由两种细胞核受体家族转导，分别是RAR（retinoic acid receptor）和RXR (retinoid X receptor)，两者能够结合形成RXR/RA
13、R异质二聚体。在没有配体存在的情况下，DNA结合的RXR/RAR复合物通过募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和组蛋白脱乙酰基酶来抑制转录过程的进行；当配体结合到复合物时，就能够诱导构像发生改变，允许募集共活化物、组蛋白乙酰基转移酶，使转录过程进行下去。PML-RAR融合基因是急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）的特异性分子标志，见于98%的APL患者中。APL患者的特异性细胞遗传学异常 t（15；17）（q22；q21），导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因（PML）和17号染色体上的维甲酸受体（RAR）形成PML-RAR融
14、合基因。正常的RAR等位基因编码野生型维甲酸受体，与维甲酸结合可以调节多个靶基因的转录。PML是POD（PML oncogenic domain）多蛋白复合体的核心组分，通过转录共激活作用，可以抑制肿瘤生长，在多种凋亡途径中起重要作用。形成PML-RAR融合基因后，维甲酸核受体基因表达受抑制，使维甲酸对靶基因的转录调节功能丧失；PML-RAR融合蛋白通过负显性抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟；PML去定位使POD的结构破坏，形成上百个细小颗粒分布在核及胞质中，正常的抑制增殖和促凋亡功能发生障碍，导致细胞大量增殖，凋亡减少，这些导致了APL的发生。形成PML-RAR融合基因的RAR部分断裂位点位于
15、2号内含子上，而PML部分的断裂位点有三种，因此将PML-RAR融合基因分为三类：1）PML断裂位点在6号内含子上的BCR1型（L型），占APL患者的55%；2）PML断裂位点在6号外显子上的BCR2型（V型），占APL患者的5%；3）PML断裂位点在3号内含子上的BCR3型（S型），占APL患者的40%。由于PML-RAR融合基因与APL发生的重要相关性，临床上已经将PML-RAR融合基因作为动态评估患者病情及预后的重要依据。E2A基因编码蛋白能够与NeuroD形成二聚体复合物，调控多种基因的转录过程。PBX1（Pre-B-cell leukemia transcription factor
16、 1）基因编码的转录因子PBX1能够与HOXB1、MEIS1和HOXB7等蛋白相互作用，形成复合物，结合到DNA上，促进转录过程的进行。临床中发现的E2A-PBX1融合基因是由t（1；19）（q23；p13）易位形成的，编码的融合蛋白中E2A氨基端转录活化域结合到PBX1同源结构域蛋白的DNA结合域上，是急性淋巴细胞白血病（ALL）中常见的染色体畸变，见于3-5%的儿童ALL患者和3%左右的成人前B-ALL患者中，在儿童前体B细胞ALL（precursor-B ALL）患者中20-25%可以检测到E2A-PBX1融合基因阳性。E2A基因13号外显子和PBX1的2号外显子断裂后相连接，形成E2A-PBX1融合基因，同时在5-10%的E2A-PBX1融合基因阳性患者中发现连接点处有27个核苷酸的突变，编码出两种不同的蛋白P85和fy77，两者只在PBX1部分的羧基端存在差异，并都具有转化特性，属于癌蛋白。近年来随着化疗方案的改进，对于E2A-PBX1融合基因阳性的ALL儿童采用更强烈的化疗方
