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1、1东亚钳蝎提取物对癫痫小鼠大脑皮层 NMDA 受体和GABAA 受体的调节作用【关键词】 东亚钳蝎提取物；,GABAA 受体；,NMDA 受体；,癫痫摘要：目的研究 BmKE 对抗戊四氮致癫痫作用及其对致痫小鼠大脑皮层NMDAR 和 GABAAR 的调节作用。方法观察戊四氮（PTZ）致癫痫模型小鼠，丙戊酸钠（VAP，阳性对照）治疗组和 BmKE 低（L） 、中（M） 、高（H）剂量治疗组小鼠癫痫发作的潜伏期，应用同位素 3H 分别标记 MK-801 和 Mucimol，检测小鼠大脑皮层 NMDAR 和 GABAAR 的结合活性。结果 BmKE（M）能显著延长 PTZ 致癫痫小鼠的发作潜伏期(P
2、0.05)，BmKE（L）作用很小，BmKE（H）治疗组癫痫小鼠发作潜伏期的延长值比 BmKE（M）治疗组低。PTZ 显著升高致痫小鼠大脑皮层的NMDAR 结合活性（P0.05） ，BmKE（L）治疗组小鼠大脑皮层 NMDAR 结合活性降低，但是无显著性差异，BmKE（M）和 BmKE（H）均极显著降低癫痫小鼠大脑皮层 NMDAR 结合活性（P0.001） 。BmKE（L）和 BmKE（H）显著提高 GABAAR 结合活性（P0.05） ，BmKE（M）极显著提高 GABAAR 结合活性（P0.001） 。结论适量的 BmKE 能够有效治疗戊四氮引起的癫痫，显著延长癫痫小鼠的发作潜伏期，BmK
3、E 抗癫痫的作用机理，可能与其抑制 NMDAR 结合活性，激活 GABAAR 的结合活性有关。关键词：东亚钳蝎提取物； GABAA 受体； NMDA 受体； 癫痫The Modulation of Buthus martensic Karch Extract（BmKE）on Cerebral Cortex NMDA Receptor and GABAA Receptor in Epileptic MiceAbstract：ObjectiveTo study the antagonism of BmKE on epilepsy of PTZinduced epileptic mice and t
4、he modulation on NMDA receptor(NMDAR) and GABAA receptor (GABAAR) binding activities in cerebral cortex. MethodsThe convulsion latent periods of PTZinduced epileptic mice，vaproate sodium（VAP，positive control drug）treating group and BmKE（L） ，BmKE（M） ，BmKE(H) treating groups were observed. NMDAR and G
5、ABAAR binding activities of cerebral cortex were detected by isotope 3H-tagged MK-801 and mulimol respectively. ResultsBmKE(M) significantly prolonged laten periods of epileptic mice(P0.05), BmKE(L) had a few effect on latent periods, the prolonged value of latent periods treated by BmKE(H) was shor
6、ter than that treated by BmKE(M). PTZ significantly increased NMDAR binding activities in cerebral cortex of mice (P0.05). Both BmKE(M) and BmKE(H) excessively decreased those of PTZ-induced epileptic mice(p0.001),but those of BmKE(L) treated group had no significant difference with those of PTZindu
7、ced epilepsic mice. GABAAR binding activities were reduced by PTZ. (P0.005). BmKE(L) and BmKE(H) 2significantly increased those of PTZinduced epileptic mice(P0.05), and BmKE(M) excessively increased those of PTZinduced epileptic mice(P0.001).ConclusionSuitable BmKE can prolong latent periods of epil
8、epstic mice induced by PTZ, and has an antiepileptic effect. The effects of BmKE may have relationship between the inhibition on NMDAR binding avtivities and excitation on GABAAR binding avtivities in cerebral cortex of epileptic mice.Key words：BmKE； GABAA receptor； NMDA receptor； Convulsion latent
9、period东亚钳蝎 Buthus martensic Karch 是我国传统药材，中医临床用干燥全虫治疗惊风抽搐、风湿痹痛等症1 。提取分离有效部位，进而纯化有效成分，对其进行药理活性的检测，研究其作用机理将进一步提高其临床应用价值。在实验性癫痫中，GABAAR 的 Cl-通道阻断剂戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）被广泛应用于诱导产生惊厥、建立癫痫动物模型。早期的研究发现，PTZ 不仅具有抑制GABAA 受体的效应2，3 ，连续注射还可引起 NMDA 受体激活，导致 Ca2+向细胞内流动4 。东亚钳蝎在中医临床上常用于同其他药物配伍，控制癫痫的发作，前期研究发现，BmKE
10、 能够延长癫痫发作的潜伏期，显著升高被戊四氮抑制的GABAAR 的结合活性5 。BmKE 是否还影响 NMDAR 的结合活性，从而克服 PTZ 的作用而达到治疗癫痫的作用，为此，我们进一步研究了 BmKE 对戊四氮致痫小鼠大脑皮层 NMDAR 的结合活性的影响。本文中我们将讨论 BmKE 对癫痫小鼠大脑皮层中 GABAAR 和 NMDAR 的调节作用，以阐明 BmKE 抗癫痫的作用机理。1 材料与方法1.1 动物选用健康昆明系小鼠（一级） ，体重（20.50.9）g，由中国医学科学院动物研究所提供，在自然光线，温度为 2025的饲养室喂养，自由进食水。1.2 药物与试剂 BmKE5 ，VAP，
11、 PTZ，Sigma 公司产品，同位素： 3HMucimol(GABAAR 拮抗剂配基)，NEN 公司，3HMK801（NMDAR 拮抗剂配基） ， Dupont 公司，闪烁剂：PPO, Fluka 公司（进口分装） ，NMDAR 测定采用BECHMANL9800 同位素液闪计数仪。1.3 动物分组及处理 昆明系小鼠 40 只，雌雄各半，适应环境 3 d 后随机分成 5 组。空白对照组服用蒸馏水 0.4 ml/只/d。其余 4 组用于 PTZ 癫痫模型的建立。1.4 PTZ 癫痫模型的建立 PTZ 诱导时间均定为下午 1：00 4：00。动物在服药前均注射 PTZ50 mg/kg。建模组动物首
12、次注射 PTZ 的潜伏期和发作等级无明显差异。于第 2 天上午 9：30 灌胃给药。空白对照组和癫痫模型非治疗组服用蒸馏水 0.4 ml /(20 gd)；VAP185 mg/kg，并设计了 3 种剂量 BmKE 服用组，其中低剂量 250 mg/kg（BmKEL） 、中剂量 500 mg/kg（BmKEM） 、高剂量 1000 3mg/mg（BmKEH） ，给药体积 0.4 ml，连续灌服 3 d。于最后一次服药后 4 h 再次腹腔注射 PTZ 50 mg/kg。 1.5 脑突触粗膜制备 为了探讨 BmKE 抗癫痫的作用机理，第 2 次腹腔注射PTZ50 mg/kg 后，将小鼠断头取脑，制备
13、操作在 4下进行。称取冻存脑组织，按 15（w/v）比例加入预冷的 50 mmol/L pH 7.4 Tris 醋酸缓冲液（TAB） ，在冰浴中用 TEKMER 组织匀浆器匀浆，用 Dupont RC5 加入 TAB 10 ml 离心（21 000 r/min，20 min） 。洗涤 3 次，最后将沉淀悬浮于灭菌的 0.32 mol/L 蔗糖溶液中，-70冻存备用。此即突触粗膜。1.6 NMDAR 结合实验 将突触粗膜离心洗涤 1 次后，用 0.5 ml TAB 稀释。取100 l 突触膜稀释液，加入 200 l TAB，在非特异性结合管中加入 100 l 0. 1 mmol/L 非标记的 M
14、K801 和 100 l TAB，每管加入 0.1 Ci 3HMK801，在30水浴中孵育 30 min，反应结束后加入预冷的 TAB5 ml，抽滤在纤维素滤膜上，并用预冷的 TAB20 ml 洗涤。将滤膜放入闪烁杯中，75左右烘烤 30 min 后加入甲苯闪烁液 7 ml，在液体闪烁计数仪上测定 cpm 值，结合突触膜蛋白质浓度计算 3HMK801 结合量（以每毫克蛋白质结合的 3HMK801pmol 数表示）：3HMK801 特异结合=（样本 cpm - 非特异结合 cpm）4.926pmol/mg ptot总计数 cpm。1.7 GABAAR 受体结合实验 总结合试管采用 3HMucim
15、ol(1 nmol/L)在 Tris 柠檬酸缓冲液（TCB，pH 7.1）中与粗膜于 2孵育 30 min，非特异性结合试管另加 10-4mmol/L GABA。反应结束后, 加入缓冲液洗涤，负压抽滤于纤维素膜，冲洗 3 遍，将该膜置于闪烁杯中，加甲苯闪烁液进行测定。特异性结合以总结合减非特异性结合得到。1.8 统计方法 采用 Cochran Cox 近似 t 检验校正其近似临界值。数据以s 表示，P0.05 为差异显著，P0.005 和 P0.001 为差异极显著。2 结果2.1 BmKE 对小鼠癫痫发作潜伏期的影响 采用治疗后癫痫发作潜伏期治疗前癫痫发作潜伏期的平均值分析，以说明提取物延长
16、发作潜伏期的程度（见表1） 。BmKE（L）作用很小，BmKE（M）的治疗效果非常明显（P0.05） ，同 VAP 相当，但是，提取物剂量的进一步增加，不仅没有增强对癫痫的治疗作用，其治疗作用反而有所下降。表 1 各组小鼠大脑皮层 NMDAR 和 GABAAR 活性比较（略）与空白对照组比较，*P0.05,*P0.005；与 PTZ 组比较与模型组比较，# P0.05, #P0.0012.2 BmKE 对 NMDAR 结合活性的抑制作用经 PTZ 诱发的癫痫小鼠大脑皮层兴奋性氨基酸受体 NMDAR 与 MK801 结合活性显著增强（P0.05） ，VAP 和BmKE（L）治疗 PTZ 诱发的癫痫小鼠后，NMDAR 与 MK801 结合活性恢复到接近正常的空白对照（见表 1） 。并且随着 BmKE 使用量的增加， NMDAR 活性的抑制程度增加，BmKE（M）比 BmKE（L）治疗组 NMDAR 的结合活性降低了接近 1 倍，与癫4痫模型小鼠相比差
