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1、蛋白质组学及其研究方法,2009年11月6日 湖南农业大学,一、蛋白质组学的相关概念,蛋白质组 澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出protein + genome = proteome 一个基因组所表达的全套蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,蛋白质组是：,对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。 在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组学,旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式 从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态
2、,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,二、蛋白组学的研究内容,蛋白质组学的研究内容主要有两个方面： 结构蛋白质组学和功能蛋白质组学 结构蛋白质组学(Structural proteomics)主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定； 功能蛋白质组学(functional proteomics)主要是蛋白质功能模式的研究， 包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。,蛋白质的各级结构,0.50nm,0.54nm,氢键,-碳原子,侧链,反平行,俯视,侧视,所以，蛋白质组学研究是对不同时间和空间发挥功
3、能的特定蛋白质群体的研究, 从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用, 为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础.,三、蛋白质组研究的理论基础,从mRNA 表达水平并不能预测蛋白表达水平。用基因表达连续分析法( SAGE) 研究对数生长期啤酒酵母的80 个基因，结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关；对某些基因，相同的mRNA 丰度翻译成蛋白的量的差异可达50 倍；而相等的蛋白量可由丰度相差40 倍的mRNA 转录而来。这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要性。,蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因序列。蛋白质
4、在翻译后可有多种调节方式，如糖基化、磷酸化、异戊二烯化、酰化作用等。此外，许多蛋白质只有与其它分子结合后才有功能，这种修饰是动态的、可逆的。,蛋白质组动态地反映生物系统所处的状态。细胞周期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态等其相应的蛋白质组之间存在差异。对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控过程,只有通过蛋白质的直接分析才能提示。,蛋白质组研究的理论基础,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,四、蛋白质组表达
5、模式的研究方法,蛋白质组表达模式（expression profile）： 研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有：双向凝胶电泳(2D electrophoresis)、以质谱(mass spectrograph)为代表的蛋白质鉴定技术,以及生物信息学(Bioinformatics)分析。,Protein sample,Image analysis,Protein in gel,Protein on membrane,Protein in solution,2-D PAGE,Excision,Blotting,Elution,Partial degradation,Peptide mixtur
6、e,Mass of protein,N-terminal sequence,MS,Edman degradation,Peptide mass fingerprint,Peptide sequence MS/MS data,Database searching,Novel or previously studied protein,Characterization of post-translocation modifications,蛋 白 质 组 的 分 析 流 程,（一）蛋白质组研究中的样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，即将细胞或组织
7、中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。 样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,三 种 常 用 的 植 物 蛋 白 提 取 方 法,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)，是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一。 由两相组成： 第一相：等电聚焦凝胶电泳 根据蛋白质电荷差异 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据蛋白质分子量差异,二维双向电泳(2D
8、 electrophoresis), 基本原理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。,IEF-focused proteins,SDS-charged proteins in IPG strip,SDS-charged proteins resolved according to sizes in SDS-PAGE gel,2-DE原理示意图,2-DE分析的基本步骤,蛋白质 溶解 变性 还原 去除蛋白 质杂志,利用不同 pK固定化 电解质可 配置不同 pH范围的 凝胶或利 用商业化 软件设计,第一相电
9、泳： IPGIFE 平衡 第二相电泳： SDSPAGE,考马斯亮 蓝染色、 银染色、 铜染色,样品制备,IPG胶制备,双相电泳,染色,2-DE的操作,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。 SDS-蛋白质复合物为雪茄形的长椭圆棒，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS -蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率只是蛋白质分子量的函数有关。,制胶：,样品处理：,电泳槽,蛋白质点的染色,凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法, 另外还
10、采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、印度墨、35S 硫脲银、胶态金、咪唑锌等. 银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色, 该法灵敏度为4 ng , 但对质谱测定有干扰, 必须先脱银. 考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色, 该法操作方便、重现性好, 同银染法一样, 质谱测定时也必须先脱色.,2-DE图像分析技术,通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或 扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和 一定边界方向的斑点电脑信号。,2-DE获得的蛋白质图谱,图像采集,斑点检测,背景消减,获得蛋白质相关信息,图像内及图像间的比较,2-DE图像分析软件包操作过程：,2-DE技术
11、的优缺点,优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点； 缺点： 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离； 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化； 丙烯酰胺有神经毒作用。,新型非凝胶技术,液相色谱法(liquid chromatography，LC) 毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE) 液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。 多维色谱技术（LC/
12、LC-MS/MS） 多维蛋白质鉴定技术,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比 （m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,主要质谱类型,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 质谱分析目
13、前是经2D -PAGE 分离的蛋白质鉴定的核心技术,（四）蛋白质组学研究的生物信息学,2D - PAGE分离的蛋白质经过识别与鉴定后，用图像扫描仪数字化2D - PAGE 胶上分离的蛋白质，在蛋白图形工作站上，应用软件，对数字化的蛋白点的分布部位，斑点面积和灰阶、背景过滤、2 - DE 匹配与比较，建立参考图谱； 对蛋白质鉴定的数据库的搜索是蛋白质组信息学的一大特点；,当用2D - PAGE 分离一个蛋白质组后,应用质谱技术测定能够刻划蛋白质属性的各种属性参数(attribute parameter) ,同时把已有数据库(如OWL 或dbEST) 中的每一个序列转换成相应属性参数,形成属性化的
14、数据库。然后以此属性参数,形成属性化的蛋白质或核酸数据库。若搜索不到,那可能是新的蛋白质,就须采用传统的生化鉴定。,蛋白质数据库,（一）蛋白质序列数据库 （二）蛋白质结构数据库 （三）蛋白质直系同源簇数据库 （四）DIP数据库 瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础,蛋白质数据库的应用,（一）序列比较 序列两两对比 多序列对比 （二）临床诊断 （三）肿瘤治疗药物的开发,五、蛋白质组功能模式的研究方法,（一）蛋白质翻译后修饰的研究 （二）蛋白质相互作用研究技术 蛋白质蛋白质 蛋白质核酸间相互作用研究,蛋白质-蛋白质相互作用的形式,1、蛋白质亚基的聚合 2、交叉聚合 3、分子识别 4、分子的自我装配 5、多酶复合体,蛋白质之间的相互作用力,蛋白质相互作用研究技术,蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫沉淀 交联 酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术,研究方法,传统技术,新技术,蛋白质-核酸相互作用的研究技术,（一）凝胶滞后试验 （二）滤膜结合 （三）甲基化干扰 （四）DNase足纹 （五）核酸-蛋白质杂交,谢谢大家！,
