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1、1不同产地的知母中总皂苷和菝葜皂苷元的含量测定作者：郭秋平，吴湖坤，关红晖，李卫民【摘要】目的考察不同产地知母中总皂苷、菝葜皂苷元的含量。方法采用香草醛高氯酸法测定不同产地知母中总皂苷的含量；采用高效液相色谱蒸发光散射法测定不同产地知母中菝葜皂苷元的含量,色谱柱 WatersNova-PakC18；流动相为甲醇水9010；流速为 1.0mlmin-1；柱温室温,漂移管温度 45；载气流速 30psi。结果河北、安徽、广东知母中总皂苷的含量为6.04%7.91，回收率为 99.28，RSD 为 2.83%(n=6)；菝葜皂苷元的线性范围为 1.656.6g(r=0.9997)，河北、安徽、广东知
2、母中的菝葜皂苷元含量为0.72%0.97%，回收率为 106.34，RSD 为 2.43%(n=6)。结论各产地知母中菝葜皂苷元含量间变异较大，以河北知母中总皂苷及菝葜皂苷元的含量最高。【关键词】知母总皂苷菝葜皂苷元高效液相色谱蒸发光散射法Abstract：ObjectiveTodeterminethecontentofAnemarrhenasaponinandsarsasapogenininAnemarrhena.MethodsThecontentofAnemarrhenasaponinwasdeterminedbycolorimetry;thecontentofsarsasapogenin
3、wasdeterminedbyHPLC-ELSD.Thecolumnwasapackedwith5mstationaryphaseWatersNova-PakC18columnandamobilephaseofmethanol-water(9010),withaflowrateof1.0mlmin-1,atatemperatureofdrifttubeof45,andthenebulizernitrogenflowratewas30psi,withauniversaldetectorEvaporationLightScatteringDetector(ELSD).ResultsAnemarrh
4、enasaponininAnemarrhenaewas6.04%7.91,andtherecoveryratewas99.28%,RSD3%(n=6).Thesarsasapogenincalibrationcurvewaslinearintherangeof1.656.6g(r=0.9997)andtherecoveryratewas106.34,RSDwas2.43%(n=6).ConclusionTherearegreatchangesamongthedifferentoriginations.ThecontentofAnemarrhenasaponinandsarsasapogenin
5、inhebeiAnemarrhenaisthemost.Keywords：Anemarrhena;Sarsasapogenin;Anemarrhenasaponin;HPLC-ELSD知母是百合科 Liliaceae 植物知母 AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥的功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘1等病证。知母的主要有效成分为知母皂苷及多糖，具有免疫活性、抗菌活性，有抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤作用，对血脂质有抑制效应，有护肝、抗肥胖效应，在骨吸收方面有重要的抑制效应等2 。知母虽为单一品种，但分布较广，各地
6、产药材之间品质差异较大。本文采用了比色法及高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLCELSD 法)比较了 3 个产地知母中总皂苷及菝葜皂苷元的含量,为更好地控制知母的质量提供了依据。1 仪器与材料21.1 仪器waters2695 型高效液相色谱仪，waters2420 型蒸发光检测器（美国 waters公司） ，岛津 AUY120 分析天平，RE2000 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂） ，HHS 精密恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂） ，unicuv-2100 紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司） 。1.2 材料知母皂苷 A3 对照品(购自中国固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号135
7、3050814),菝葜皂苷元对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号110744200509） ，香兰素（国药集团化学试剂有限公司，批号 20050718） ，甲醇（色谱纯，德国 Merck 公司） ，乙醇、氯仿、丙酮、高氯酸（分析纯，天津大茂化学试剂厂） ，不同产地的知母药材购自广州清平市场，经广州中医药大学中药鉴定教研室徐鸿华教授鉴定为百合科知母。2 方法与结果2.1 香草醛高氯酸法测定各产地知母中总皂苷的含量2.1.1 溶液的制备对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷 A3 对照品2.90mg，置 25ml 量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度。供试品溶液的制备：分别称取河北安国、安徽、广东知母
8、粉末（过 4 号筛）各 1.00g，加 70乙醇 20ml 水浴回流 3 次，1h/次，滤过，滤液定容至 100ml。取 25ml 回收至干，加水 10ml 溶解，用水饱和正丁醇萃取 3 次，15ml/次，回收正丁醇液，用甲醇定容至 10ml。从中吸取 0.1ml 水浴蒸干，加 5香草醛冰醋酸 0.2ml，高氯酸 0.8ml，70水浴 15min，取出冰浴 5min，加 5ml 冰醋酸，545nm 测定吸光度。2.1.2 线性关系考察精密吸取对照品溶液 0.5，1，2，3，4，5ml 水浴蒸干，加 5%香草醛冰醋酸 0.2ml，高氯酸 0.8ml，70水浴 15min，取出冰浴，加5ml 冰醋
9、酸。于 400800nm 波长处扫描，测定最大吸收波长。于 545nm 处测定吸收度，以知母皂苷 A3 含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=1.3374X+0.1386，r=0.9999。结果显示，知母皂苷 A3 对照品在0.0580.58mg 范围内线性关系良好。2.1.3 精密度实验取浓度为 0.08mg/ml 的对照品溶液，重复测定 5 次，吸光度平均值为 0.45，RSD 为 0.18%，范围表明仪器精密度良好。2.1.4 稳定性实验取样品安徽知母皂苷溶液，分别于 0,24，48h 测定，吸光度平均值为 0.37，RSD 为 0.25%，表明本品 48h 内具有
10、良好的稳定性。32.1.5 重复性实验取同一批次的安徽药材 6 份，按供试品溶液制备方法制成样品测定，测得样品知母皂苷含量的平均值为 68.21mg，RSD 为 0.45%。表明本法具有良好的重复性。2.1.6 准确度实验称取安徽知母粉末 0.50g，加入对照品 8mg，按供试品溶液制备方法制成样品。测得平均回收率为 99.28%，RSD 为 2.83。2.1.7 样品含量测定取各个产地的知母药材 3 份，精密称定 1.00g，按供试品溶液制备方法制成样品，依法测定。结果见表 1。结果表明,河北安国知母中皂苷含量最高，达 7.91，安徽知母次之，而广东知母中皂苷含量较低，仅为6.04。表 1
11、不同产地知母中总皂苷含量测定结果（略）2.2HPLCELSD 法测定不同产地知母药材中菝葜皂苷元的含量2.2.1 色谱条件色谱柱：WatersNova-PakC18(3.9mm150mm，5m)；柱温为室温；流动相为甲醇水（9010） ；流速 1.0mlmin-1；漂移管温度 45，载气流速 30psi。2.2.2 溶液的制备对照品溶液的制备：精密称取菝葜皂苷元对照品适量，加甲醇溶解制成 0.33mg/ml 的溶液。供试品溶液的制备：分别称取安徽知母、河北知母、广东知母粉末（过 4 号筛）各 0.50g，精密称定，加乙醇 25ml，水浴回流 3 次，40min/次，滤过，滤液回收乙醇至干，加
12、20ml2molL-1 盐酸，水浴回流 5h，放冷至室温，用氯仿萃取 3 次，20ml/次，合并氯仿提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转溶至 10ml 容量瓶中，并定容至刻度。2.2.3 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液5.0，8.0，10.0，13.0，15.0，20.0l，依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以菝葜皂苷元含量的自然对数为横坐标，色谱峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y1.6395X11.548，r=0.9997。结果表明，菝葜皂苷元对照品在 1.656.6g 范围内呈良好的线性关系。菝葜皂苷元对照品色谱图见图 1。2.2.4 精密度实验精密吸取对照品溶液
13、 5l，重复进样 5 次，测定峰面积平均值为 235113.40，RSD 为 1.29%，表明仪器精密度良好。2.2.5 稳定性实验取广东知母溶液，分别于 0,24，48h 测定，进样 10l，结果显示，0,24，48h 测定，广东知母中菝葜皂苷元的峰面积平均值898011，RSD 为 1.63，表明本品 48h 内具有良好的稳定性。2.2.6 重复性实验取同一批次的安徽知母 6 份，分别独立按供试品溶液制备方法制成样品溶液，在上述色谱条件下测定，测得的平均含量为 4.79mg，RSD为 2.82%。表明方法重复性良好。2.2.7 准确度实验取本品粉末（过 4 号筛）0.50g，精密称定一定量
14、的对照4品，按供试品溶液制备方法制成样品溶液，精密吸取 5l，在上述色谱条件下测定 6 次，计算回收率。结果显示平均回收率为 106.34%，RSD 为 2.43%，表明菝葜皂苷元回收率良好。2.2.8 样品含量测定取各个产地的知母药材 3 份，精密称定 0.50g，按供试品溶液制备的方法处理，在上述色谱条件下测定。结果见表 2。结果显示，测得河北安国知母中菝葜皂苷元的含量最高，达 0.97%，安徽知母与之相当，为 0.96%，广东知母中菝葜皂苷元含量较低为 0.72。知母药材溶液色谱图见图 2。表 2 不同产地知母中菝葜皂苷元含量测定结果（略）3 讨论知母根茎中含甾体皂苷约为 6，有知母皂苷
15、 A1，A2，A3，A4，B1，B2 等。本实验以知母皂苷 A3 为对照，测得的总皂苷含量均大于 6，菝葜皂苷元为知母中几种主要甾体皂苷的母核皂苷元,因此可通过测定菝葜皂苷元的含量对知母药材的质量进行控制，本实验中皂苷元与皂苷测定结果一致，均为河北知母含量最高，同时论证了河北知母为道地药材。河北知母及安徽知母中菝葜皂苷元含量均大于 0.90%,符合中国药典规定知母饮片的含量大于 0.9%的要求,而广东知母菝葜皂苷元含量未达到中国药典要求。根据 ELSD 的检测原理，响应信号(散射光强度)与雾滴中的样品浓度呈指数关系，即峰面积的自然对数与样品浓度的自然对数呈线性关系，因此在本实验中以峰面积和样品浓度的对数值进行线性回归得标准曲线。ELSD 检测器的操作参数有流动相的流速、漂移管温度及气体流速。本实验在色谱条件固定的情况下，选择合适的检测参数，使信噪比最高。通过对 HPLC-ELSD 法各方面进行考察，其精密度、稳定性、准确度等指标均能符合要求，且有较高的专属性和灵敏度，说明 HPLC-ELSD 法可用于测定知母药材中菝葜皂苷元的含量。【参考文献】1国家药典委员会中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2005：148.2杨丽蓉.知母化学成分及药理作用的研究进展J.国外医学中医中药分册，2002，24（4）：207
