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1、1不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究作者：潘天玲，李坤平，林赞菲，黄碧玲【摘要】目的测定 13 个不同产地布渣叶样品中总黄酮含量及其清除自由基活性。方法采用 Al(NO3)3NaNO2NaOH 体系比色法测定总黄酮含量，采用1,1 二苯基2 苦基肼自由基（DPPH） 、羟自由基（OH）和超氧自由基（O2-）等模型测定布渣叶总黄酮清除自由基活性。结果各产地总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了 55.22mgg-1，平均为27.06mgg-1。各产地总黄酮样品均具有清除 DPPH活性，其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系；但其清除OH 和
2、O2-活性与总黄酮浓度关系不明显。结论不同产地布渣叶总黄酮含量差异较大；各产地布渣叶总黄酮均具有较好的自由基清除活性。【关键词】布渣叶；总黄酮；自由基；清除活性Abstract:ObjectiveToanalyzethecontentsoftotalflavonoidsinMicrocospaniculataL.fromdifferenthabitatsandtheradicalscavengingactivityoftotalflavonoids.MethodsContentsoftotalflavonoidsintheextractswereanalyzedbyspectrophotome
3、trybasedonAl(NO3)3NaNO2NaOHreactionsystem,andtheradicalscavengingactivitytowards1,1diphenyl2picryhydrazyl （DPPH)radical,hydroxylradical（OH）andsuperoxideanionradical（O2-）,weredeterminedinvitro.ResultsContentsoftotalflavonoidsinMicrocospaniculataL.variedwithhabitatsand55.22mgg-1wasthehighest.Theaverag
4、econtentwas27.06mgg-1.AllthesampleshadradicalscavengingactivityagainstDPPH,OHandO2-.TherewasacleardoseeffectrelationshipbetweentheradicalscavengingactivityagainstDPPHandtheconcentrationofflavonoids,butnothisrelationshipwasfoundwhenagainstOHandO2-.ConclusionContentsoftotalflavonoidsinMicrocospanicula
5、taL.variedwithhabitats,andalltheplantshaveradicalscavengingactivity.Keywords:MicrocospaniculataL.；totalflavoniods；radicalscavengingactivity自由基是生物体内化学性质极其活跃的物质，其大量存在会对生物膜、蛋白质、核酸等生物大分子造成危害。研究表明，肿瘤、衰老、心脑血管等疾病的发生与其有着密切的联系1,2 。黄酮类化合物是自然界广泛存在的一类天然产物，具有抗氧化、抗突变、抗衰老等多种生物活性，其自由基清除活性是当前的研究热点之一1-3 。布渣叶，椴树科植物破布树
6、（MicrocospaniculataL.）的叶，主要分布于我国广东、广西、海南等地，富含黄酮类成分4-7 ，但未见有关其抗氧化和清除自由基活性的报道。本文对不同产地布渣叶总黄酮含量进行了分析，并选择了2DPPH、OH 和 O2-等体外模型对其自由基清除活性进行了考察，旨在为其进一步的开发利用提供科学依据。1 仪器与试药数控超声波清洗机（KH400KDB 型，昆山禾创超声仪器有限公司，40kHz，320W） ，RE52AA 旋转蒸发器（河南巩义英峪予华仪器公司） ，TU1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） 。D101 大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司） ；芦丁（中国
7、药品生物制品鉴定所，批号：050923） ；1,1 二苯基2 苦基肼（DPPH，Sigma 公司） ；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、甲醇、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸均为市售分析纯。布渣叶，2008 年 7 月9 月采自广东广州、阳江、化州、顺德、中山、沙坪、阳春、龙口、电白；广西来宾、玉林、武鸣；海南儋州等地，由广州中医药大学中药学院李卫民教授鉴定为椴树科植物破布树（MicrocospaniculataL.）的叶，干燥，粉碎，备用；药材存放在广东药学院制药工程教研室。2 方法2.1 供试品溶液的制备6，7精密称取不同产地布渣叶各 2.500g，加入体积分数
8、70%乙醇 50mL，于 30下超声提取 2 次，第 1 次 30min，第 2 次 20min；合并两次滤液，减压回收至无醇味，加水至 100mL，静置，过滤，将滤液倒入已放有 10g 预处理好的 D101 树脂的锥形瓶中，振荡吸附 12h 后过滤，分别用 50mL 去离子水、30mL 体积分数20乙醇和 30mL 体积分数 95乙醇洗脱；收集体积分数 95乙醇洗脱液，减压蒸干后用甲醇溶解并定容至 25mL，即得。2.2 标准曲线的制备5精密称取 120干燥至恒重的芦丁对照品 10.2mg，置 50mL 容量瓶内，用体积分数 70%乙醇溶解并稀释至刻度，即得芦丁对照品溶液。精确吸取0.4、0
9、.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0mL 芦丁对照品溶液于 10mL 量瓶中，分别补加体积分数 70乙醇至 5mL；然后顺次加入质量分数 5%NaNO2 溶液 0.3mL，放置 6min，质量分数 10%Al(NO3)3 溶液 0.3mL，放置 6min，质量分数 4%NaOH 溶液4mL，再加入体积分数 70%乙醇溶液至刻度，摇匀，静置 15min 后于 510nm 处测定吸光度值。以吸光度 A 对芦丁质量（m）进行线性回归，得到回归方程：A=1.33175m-0.00449（r=0.9989） 。在 0.08160.604mg 范围内，线性关系良好。23 总黄酮含量的测定方法取各待
10、测样 0.1mL，按上述标准曲线显色方法显色后在 510nm 处测定吸光度3值 A，根据上述标准曲线方程计算总黄酮质量。2.4 清除 DPPH活性测定1，2精密称取 DPPH2.74mg，用 95乙醇溶解并定容至 100mL。精密量取 DPPH 溶液 2mL，加入 0.1mL 经适当稀释的供试品溶液，混匀，30min 后于 517nm 波长处测定其吸光度值，以(1)式计算清除率。E(%)=A0AtA0100%(1)式中，E:清除率；A0：初始 DPPH 溶液的吸光度；At：加入供试品溶液30min 后 DPPH 溶液吸光度。2.5 清除OH 活性测定利用 Fenton 反应进行测定2,8 ，标
11、准反应体系中含9.8mmoL/LH2O22mL，9mmoL/LFeSO42mL,9mmoL/L 水杨酸乙醇溶液 2mL，供试品溶液 2mL；以 H2O2 启动反应，37反应 30min 后在 510nm 波长处测吸光度值，以(2)式计算清除率。E(%)=AsAbA0-Ab100%(2)式中 E：清除率；A0：不加 H2O2 反应体系吸光度；As：标准反应体系吸光度；Ab：不加供试品反应体系吸光度。2.6 清除 O2-活性测定采用邻苯三酚自氧化法2,8 ，取 TrisHCL 缓冲溶液（0.05moL/L，pH8.2）4.5mL，供试品溶液 0.1mL，混匀，加入 2.5mmoL/L 邻苯三酚溶液
12、 0.4mL,摇匀后于 25恒温水浴反应 4min，最后加入 2 滴盐酸（8moL/L）终止反应，测定溶液在 320nm 波长处的吸光度值，以(3)式计算清除率。E(%)=A0(AsAb)A0100%(3)式中 E：清除率；A0：不加样品时反应体系的吸光度；As：标准反应体系吸光度；Ab：不加邻苯三酚溶液反应体系吸光度。3 结果与分析13 个不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮清除 DPPH、OH 和 O2-自由基活性分析结果见表 1。表 1 不同产地布渣叶总黄酮及其总黄酮自由基清除活性结果（略）由表 1 可见，各产地布渣叶药材总黄酮含量差异较大，其中以广西来宾样品含量最高，达到了 55.22mgg
13、-1，广东电白样品总黄酮含量最低，仅为410.76mgg-1；不同产地样品平均总黄酮含量为 27.06mgg-1。13 个样品均具有一定的清除 DPPH的能力，且其自由基清除率随供试品总黄酮浓度的增大而提高，呈现一定的量效关系，其清除率（Y）和总黄酮浓度（C）的关系可以表达为 Y=1.194C+7.298（r=0.966） 。同样，13 个样品产地的布渣叶样品均具有一定的清除OH 和 O2-的能力，但其量效关系不明显，平均清除率分别为（28.9254.626）%和（44.519.147）%。整体上，对OH 清除效果较稳定但清除率较低，对 O2-大部分样品清除率较高，但不同产地布渣叶总黄酮样品清
14、除率差异较大，这可能与总黄酮样品中具体的组分不同有较大关系，具体因素还有待进一步探讨。4 讨论4.1 不同产地布渣叶因种源遗传性状、生长的地理环境、采收季节等因素不同导致其总黄酮含量各异是正常的。从上述分析结果来看，布渣叶药材的总黄酮含量可以作为其质量控制指标，但此次研究选择样本量较少，且未能考虑其采收时间等因素的影响，其总黄酮平均含量 27.06mgg-1 仅可作为药材质量控制的参考依据。4.2 由 13 个不同产地布渣叶总黄酮自由基清除率的测定结果可知，布渣叶总黄酮具有清除 DPPH、OH 和 O2-自由基活性，是一种值得开发的自由基清除剂，其构效关系尚需进一步研究。致谢：感谢广东药学院黄
15、纪云、简银彩、张樱丰等同学，广西大学陈丛谨老师和海南大学陈致水老师在研究过程中给予的帮助。【参考文献】1ALOTHMANM,RAJEEVBHATAA.KarimAntioxidantcapacityandphenoliccontentofselectedtropicalfruitsfromMalaysiaextractedwithdifferentsolventsJ.FoodChem，2009,115(3):785-788.2LIHaiyun,HAOZaibin,WANGXiuli,etal.AntioxidantactivitiesofextractsandfractionsfromLysi
16、machiafoenumgraecumHanceJ.Bioresourcetechnol,2009,100(2):970-974.3HAVSTEENBH.ThebiochemistryandmedicalsignificanceoftheflavonoidsJ.PharmacolTherapeut,2002，96:77-80.4张丽萍,罗集鹏.布渣叶的药学研究与临床应用概述J.中药材,52008,31(6):271-272.5潘天玲,李坤平,贲永光,等.正交试验法优化布渣叶总黄酮提取工艺的研究J.广东药学院学报,2008,24(5):454-456.6李坤平,贲永光,李卫民,等.大孔吸附树脂对布渣叶总黄酮的富集纯化特性研究J.广东药学院学报,2008,24(6):539-542.7李坤平,
