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1、第五章 固相析出分离法,目的：浓缩；初步纯化 ；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,概述,固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分离的操作技术。,固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。,固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用
2、的方法。优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,盐析法 有机溶剂沉淀法固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法,结晶法：析出物为晶体。沉淀法：析出物为无定形固体。,固相析出法分类,第一节 盐析法第二节 有机溶剂沉淀法第三节 其它沉淀方法第四节 结晶,第一节 盐析法,一、基本原理二、影响因素三、盐析操作,定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭,7,两种现象：盐溶：低盐情
3、况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小,8,2017/5/23,南京农业大学 生命科学学院,9,2017/5/23,南京农业大学 生命科学学院,10,一、基本原理,11,盐析作用（salting out）原理,破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。,破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。,logS=-KsS蛋白质溶解度，g/L；盐离子强度, Cii离子浓度，mol/L；Zii离
4、子化合价；常数,为纵坐标上的截距;Ks盐析常数。,13,盐析和KS盐析,右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式,两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作盐析法。 由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）,14,二、影响盐析的因素,1.无机盐的种类,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作
5、用较弱阴离子盐析效果 ：柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+ K+Na+ 高价阳离子阴离子的影响大于阳离子,盐析用盐的选择盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，（4）不易引起蛋白质变性。,缺点：（1）水解变酸；（2）高pH 释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。,不同种类蛋白质所需的无机盐量不同先后加入不同量无机盐分级沉淀蛋
6、白质,2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、,不同蛋白溶解度与离子强度的关系,盐析分布曲线,19,蛋白质浓度不同：所需无机盐用量不同蛋白质浓度高：所需无机盐量少制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。,3.溶质（蛋白质等）浓度：23%,不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线,无机或稀盐溶液：T蛋白质溶解度高盐溶液： T蛋白质溶解度蛋白质：室温盐析对温度敏感的酶，0C4C,4.温度：,温度对溶解度的影响,5.pH：,Pl盐析注意高盐下pl的偏移：与负离子结合向低pH偏移，与正离子结合向高pH偏移利用蛋白质pl的不同：可分级沉淀蛋白质,三、盐析操作,1.盐析
7、用盐的浓度表示,硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。,盐析用盐量的表征-饱和度：,饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例：250C
8、时，硫酸铵的饱和浓度是767g/L定义为100%饱和度目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,盐析方法：1）分步盐析法(不同的盐浓度)2）重复盐析法高蛋白质浓度下共沉淀重复盐析提高纯度3）反抽提法(相同盐浓度),2、盐析方法和注意事项,分级盐析法不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物,单酶盐析曲线,双酶盐析曲线,反抽提法共沉淀较低浓度盐溶液溶杂蛋白,大肠杆菌RNA聚合酶的制
9、备,防止“局部过浓”：慢加，搅拌温度：不宜过低，室温1025C，易失活：010C时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离,注意事项：,第二节 有机溶剂沉淀法,一、基本原理二、影响沉淀效果的因素,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。,优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）溶剂易除去3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点：1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高，需防火防
10、爆总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,一、基本原理,1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 脱水作用比静电作用强,一些溶剂的介电常数,35,二、影响沉淀效果的因素,1.有机溶剂种类及用量能与水无限混溶介电常数小、沉淀强变性小毒性小，挥发性适中,常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲醇（口服毒性） 介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
11、丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；用量：（了解）,2.pH的影响Pl附近、稳定性控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导致共沉淀。,严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应预冷（有机溶剂-10以下，蛋白质0左右），在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。温度影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。,3.温度,低浓度缓冲液（0.01-0.05mol/L），0.2mol/L）：盐溶，增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，会增加溶媒用量，沉淀物中可能夹带盐，需除盐常用的中性盐为醋酸钠、
12、醋酸铵、氯化钠等。,4.无机盐的含量,5.某些金属离子的助沉淀作用,Zn、Cu等与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，而活性不变，有助于沉淀，降低有机溶剂用量。胰岛素精制：,6.样品浓度,较稀：溶剂量，收率，稀释变性较高：共沉淀，分辨率，溶剂量，回收率，变性小蛋白质初浓度：0.5%2%粘多糖：12%,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 ,第三节
13、其它沉淀方法,一、等电点沉淀二、成盐沉淀法三、亲和沉淀四、高分子聚合物沉淀法五、表面活性剂沉淀法,一、等电点沉淀法原理：Pl时分子表面静电荷为零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。,常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,二、成盐沉淀法,1.金属离子沉淀所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。分离沉淀复合物分解除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA）,应用： 目的蛋白分离，去杂质缺点：有时复合物分解较困难，蛋白质易变性,2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。,单宁：结合后牢固，竞争结合法分解雷凡诺：不影响蛋白质活性三氯乙酸（TCA）：变性，除杂蛋白,雷凡诺,猪心提取液 洗脱液 上清液 上清 细胞色素C 沉淀（去除）,吸附,人造沸石,盐析,
