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1、红细胞计数、红细胞形态检查、血红蛋白测定,检验系临检教研室 陈丽华,目的要求,1.掌握：红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义 ； 红细胞形态。 2.了解：血红蛋白测定其他方法 。,重点 :红细胞计数、血红蛋白测定的原理、血片 红细胞形态、 难点:红细胞检验的形态、质控。,目的要求,一、概 述,1.红细胞的生成,骨髓造血干细胞-红系祖细胞-原红细胞- 早幼-中幼-晚幼-网织红细胞-成熟红细胞,Epo,每个原红细胞可以生成16个红细胞。,48h,无分裂能力,2.红细胞的破坏,健康人红细胞平均寿命120天。 红细胞主要因衰老而消亡，破坏主要在单核-巨噬
2、细胞系统，器官主要是在脾脏和肝脏；其次为骨髓和其他部位。,二、红细胞计数,红细胞计数（red blood cell count,RBC）即测定单位体积内红细胞数量。是血液一般检验的基本项目，常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。,测定方法,显微镜计数法,血液分析仪法,（一）显微镜计数法,【检测原理】 采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞数量。,【器材】 微量吸管，采血针，小试管，计数板，盖片，棉球，显微镜。 【试剂】红细胞稀释液：任选一种 1.Hayem稀释液：氯化钠1.0g、硫酸钠（含10个结晶水）5.0g，氯化
3、高汞0.5g，蒸馏水加至200mL，过滤后使用。 氯化钠-调节渗透浓度 硫酸钠-提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞-防腐剂，有毒,2.柠檬酸盐甲醛盐水 氯化钠 0.6g 调节渗透压 柠檬酸钠 1.0g 调节渗透压，抗凝 36%甲醛 1ml 防腐 蒸馏水加至100ml，过滤2次后使用。 3.生理盐水或加1%甲醛的生理盐水,【操作】 1.中号试管（15100mm）加等渗稀释液2ml； 2.毛细血管采末梢血10l加入上述稀释液，立即摇匀（稀释200倍）； 3.充池，静置2min后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央5个中方格内的红细胞数。,未染色红细胞呈双凹盘形，有黄绿色折光。,红细胞计数,2ml稀释液
4、 充分混匀 10ul血液 充池、静止 镜下计数,3mm WBC WBC WBC WBC 1mm,红细胞数/L=5个中方格内红细胞5 10 200 106/L 或 = 1012/L,5个中方格内红细胞数,100,【报告方式】,【计算】,RBC（/L）= . 1012/L,【方法学评价】 1手工显微镜法 2血液分析仪法 为目前主要临床检验细胞计数方法 变异系数（coefficient of variation, CV ）小。,【质量控制】 1手工法 误差来源包括：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差） 2仪器法 严格按操作规程；定期作室内和室间质控。,【参考值】 男性 : （4.00-5.50）
5、 1012/L 女性 : （3.50-5.00） 1012/L 新生儿:（6.00-7.00） 1012/L,【校正】WBC100109/L时，需校正： 实际红细胞/L=所数细胞总数白细胞数 （正常红细胞：白细胞=750：1, 可忽略白细胞的影响）,【注意事项】 1.采血及摇匀迅速，防止血液凝固； 2.器械应防酸防碱且干燥； 3.充池要摇匀； 4.计数时，应识别酵母及白细胞。,三、血红蛋白测定,（一）血红蛋白的结构,血红蛋白结构： 由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。,空间结构：每个血红蛋白有4条珠蛋白肽链， 每条肽链包裹1个亚铁血红素，形成具有 四级空间结构的四聚体。,【分类】（每个珠蛋白分子含两
6、条 链和两条非 链） 正常人：HbA （ 22） 占90% 成人主要血红蛋白； HbA2（ 22 ） 占2%-3% 成人次要血红蛋白 HbF （ 22 ） 占2%以下 胎儿主要血红蛋白,生理情况下，99%Hb的铁呈Fe2+状态，称为还原血红蛋白，亚铁状态的Hb与氧结合称氧合血红蛋白（HbO2). 1%Hb的铁呈Fe3+状态，称为高铁血红蛋白（Hi）。,Hb的合成受激素的调节：Epo和雄激素。,注意事项：1. 如-链或-链合成障碍，使三种正常血红蛋白比例异常，即各型地中海贫血；如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白病 。 2.病理情况下可出现硫化血红蛋白（SHb）。,（二）血红蛋白衍生
7、物及其吸收光谱,1.氧合血红蛋白（oxyhemoglobin, HbO2）:Hb与O2结合时形成。 2.还原血红蛋白（reduced hemoglobin, Hbred）：未与O2结合时的Hb。 3.高铁血红蛋白（hemiglo -bin, Hi）或正铁血红蛋白（methemoglobin, Mhb）: Fe 2+被氧化成Fe 3+。,4.碳氧血红蛋白（HbCO）、硫化血红蛋白（SHb）：与O2结合的配位键被CO、S等占据。 5.氰化高铁血红蛋白（HiCN）：Hi与CN-结合而成。波峰540nm，波谷504nm。,正常情况下，血液中血红蛋白主要是HbO2和Hbred，以及少量HbCO和Hi。,
8、（三）血红蛋白测定方法,手工法：,HiCN法,SLS-Hb法,AHD575法,HiN3法,血液分析仪法,1、氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法,1）原理：在Hb转化液中，除SHb外，Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与CN-结合，生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN），吸收峰为540nm，毫摩尔消光系数为44 Lmmol-1 cm -1 。因此根据标本的吸光度，即可求得血红蛋白总量（不含SHb）。,2）器材： 分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。 3）试剂：血红蛋白转化液（文齐液）成分如下 高铁氰化钾：使Hb转化成Hi 氰化钾：使Hi形成HiCN 无水磷酸二氢钾：防止混浊，调节pH
9、值 TritonX100:非离子型表面活性剂，加速溶血，缩短转化时间，防止因血浆蛋白改变引起的混浊。,4）操作： a. 取指血20ul，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静置5分钟。 b. 用分光光度计比色。波长540nm，以空白转化液调零，测定吸光度“A”。,5）计算 标准状态下的计算 Hb（g/L）=A 251A 367.7 其中，A为测得的吸光度，64458为Hb的分子量， 251为测定时血液稀释倍数，44为HiCN的毫摩尔吸光系数，1000为换算成摩尔吸光系数。,64458,441000,非标准状态下的计算：求换算常数K 标准液标定Hb液浓度 (标准值) K= - 本室测定标准液的“A
10、” (测定值) 标本Hb g/L = 标本测定值A,举例：用不同浓度的Hb的标准品：50，100，150，200g/L测得的吸光度分别为0.13, 0.27, 0.41和0.54 。则K值为 K= = =371.75 若测定管吸光度为0.32，则测定管Hb浓度为 Hb（g/L）=0.32371.75=118.96,Hb,A,50+100+150+200,0.13+0.27+0.41+0.54,6)结果报告 Hb g/L 7)参考值 成年男性：120-160 g/L 成年女性：110-150 g/L 新生儿： 170-200 g/L,贫血分级： 轻度：男性120g/L,女性110g/L 中度：
11、90g/L 重点： 60g/L 极重度：30g/L,8）质量保证 废弃物：KCN为剧毒药品，要小心对待，实验完后要用次氯酸钠溶液处理后才能弃倒。 b. 器材及试剂：血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中，否则CN-下降使结果偏低。 c. 标本：下列因素可引起Hb假性增高：脂血症、血液浓缩、白细胞30109/L，重症黄疸，严重的血管内溶血等。,2、方法学评价,1）HiCN法：由国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐，并经WHO确认为血红蛋白测定的参考方法。 优点：操作简单，结果稳定可靠，试剂容易保存 能测定除SHb以外的所有血红蛋白，并易 于建立质控。,缺点：不能测定SHb。 对HbCO转化太慢，需要
12、100分钟。 高丙种球蛋白血症，变性Hb血症，高白细胞的血可出现混浊，按15g/L（pH7.27.5）甚至50g/L（pH6.76.9）加入氯化钠可防止，高浓度有核RBC引起的混浊不能防止。 KCN为剧毒，需妥善保存。,2)SDS-Hb（十二烷基硫酸钠）法,优点：试剂无毒，结果准确，重复性好 缺点：SDS纯度难保证； 依赖HiCN法，间接得到结果； 试剂可破坏WBC，不能与WBC同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。,3）叠氮高铁血红蛋白法（HiN3）,优点：准确度、精密度较高 缺点：试剂仍有毒性，HbCO转化慢 本法与HiCN法相似,4）碱羟血红蛋白法（AHD575）,优点：试剂简易，不含毒
13、性，呈色稳定，准确性与精确性较高。 缺点:波峰位于575nm处，溶液中碱性较高，不适用于自动检测，HbF不能转化。,5）CTAB法,优点：溶血性强且不破坏白细胞，适于血液分析仪检测。 缺点：精密度、准确度略低。,沙利法为传统血红蛋白测定法，已淘汰。,6）血液分析仪法,优点：简便、快速、多项。 缺点：仪器型号不同，使用的溶血剂不同，形成的Hb衍生物不同。 某些溶血剂形成的Hb衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂的量及作用时间。,对具有抗溶血剂作用的疾病（肝病、低色素性贫血），溶血不完全而影响结果。 有些溶血剂内虽加入了KCN，但其衍生物并非HiCN，而是氰化血红蛋白，仪器需经过HiCN标准液校
14、正后，才能进行Hb测定。,（四）Hb与RBC测定的临床意义,参考值 RBC Hb 男性 （4.05.5）1012/L 120160g/L 女性 （3.55.0）1012/L 110150g/L 新生儿 （6.07.0）1012/L 170200g/L 70岁男性 94.2122.2g/L 70岁女性 86.5111.8g/L,（1）生理变化,1）年龄与性别 新生儿 6个月2岁婴儿 ，生长发育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性贫血。 老年人 ：对营养摄取、利用和造血功能减退，RBC、Hb比中青年人低。 男性女性：雄激素,2）精神因素：情绪波动，使肾上腺素增多，RBC、Hb 3）气压：气压低（高山居民），红细胞代偿性 4）长期多次献血者，红细胞代偿 5）妊娠期 ：妊娠期血容量明显 ，引起血液稀释，Hb常在100g/L以下，生理性贫血。,（2）病理变化,1）RBC和Hb增多 指单位容积血液中红细胞数值及血红蛋白含量高于正常值高限。 男性 Hb 170g/L 女性 Hb 160g/L RBC 6.01012/L RBC 5.51012/L,相对性增多：由于大量失水、血浆量下降而使血液浓缩所致，如呕吐、严重腹泻、大面积烧伤等。 绝对性增多：见于慢性心肺疾病，真性红细胞增多症。,2）红细胞和Hb减少：贫血 骨髓造血功能低下：如再障、白血病、恶性肿瘤 造血原
