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1、肠道致病菌的检验与鉴定,第一节 概述,一、食品中常见的肠道致病菌 沙门氏菌 志贺氏菌 大肠艾希氏菌 变形杆菌 耶尔森菌,二、生物学特性,1、形态与染色 均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。 2、培养和生化反应 （1）需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。 （2）肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。 （3）可还原硝酸盐为亚硝酸盐。,三、抗原类型,四、 致病性,（一）、致病物质 1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，血压降低，严重者休克。 2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有特殊毒害作用
2、，引起腹泻。,（二）、所致病疾 1、伤寒和副伤寒 2、食物中毒 3、细菌性痢疾,五、微生物检验的基本程序,检样处理增菌培养分离培养生化试验血清学鉴定报告,第二节、沙门氏菌检验,一、概况 （一）沙门氏菌的命名 根据所致疾病命名 根据菌的发现地区命名 以发现者的名字命名 （二）沙门氏菌的抵抗力 60 30可杀死,（三）沙门氏菌的分类地位及定义,1、地位：是肠杆菌科中的细菌 2、定义 肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰氏阴性杆菌。,二、生物学特性,（一）、形态与染色： 革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。 （二）、培养特性 1、需氧
3、或兼性厌氧，最适温度37，PH7.27.4。,(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞,2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37 ，24h，能形成菌落中等大小，直径23mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。,（三）、生化特性 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气） 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金盏花醇 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（VP）（-）， 4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+） 5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）,（四）、抗原结构
4、主要两种： A、O抗原 B、H抗原 C、表面抗原（K抗原） D、菌毛抗原,2 、O抗原 （1） O抗原的表示方法 共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1 、O2 、O3、 O4 如： 伤寒杆菌： O9 、O12,（2）沙门氏菌的分群及表示方法 用大写字母及相关符号表示： A、B、C、D、E 、 O51 O63、 O65 O67,（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原 A群-O2 B群-O4 C群-O6 C1群-O7、 C2群- O6 O8 、 C3群-O8 、 C4群-O6 O7 O14 D群-O9 F群-O11 E群-O3 E2群-O3、 O10族 E3群-O3、 O15 E4群-O
5、1 、O3 、O19,3、H抗原（鞭毛抗原）,耐热性差：6015或酒精处理可破坏 沙门氏H抗原有两种： 第1相：特异相，用英文小写字母表示a、b、cz z1z55 第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3其中也有用小写字母a、n、x等表示。,4、表面抗原：,沙门氏菌有三种：Vi、M、K抗原 Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60 30，100 5 含有Vi 抗原的沙门氏菌： 伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌,三、沙门氏菌食物中毒,（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌： 鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌 （二）、易
6、引起沙门氏菌中毒的食品 肉、蛋、乳类食品,行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌,(三)、中毒原因,1、食用病畜禽的肉制品食品 2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染 3、用不洁净水处理食品,（四）、临床病状（所致病菌）,1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。 由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期720天 2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程23天 3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引起,四、微生物检验,（一）、基本步骤（程序） 检样增菌（前增菌）分离培养生化试验初步鉴定血清学反应最后鉴定报告,1、前增菌：用无选择性的培养基使处于
7、濒死状态的细菌恢复活力; 2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制; 3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌; 4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌; 5、血清学鉴定：进一步鉴定。,（二）、检验操作关键点,1、前增菌：使待检菌复壮 前增菌：增菌液一般用BPW, 36，1824h，长有杂菌。 2、选择性增菌：抑制杂菌生长，提高检出率 选择性增菌：增菌液用TTB 421，1824h和SC 36，1824h。,2、平板分离,选择性培养基：BS、XLD（或HE、显色培养基） BS：黑色金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些形成绿色的菌落，周围培养基不
8、变。 HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎黑色；有些为黄色，中心黑色或几乎全黑。 XLD：粉红色，带或不带黑色中心，可呈大的带光泽的黑色中心，或全黑色菌落；有些菌落为黄色，带或不带黑色中心。,BS上的菌落,HE上的菌落,显色培养基上的菌落,XLD上的菌落,3、五项生化试验,H2S、靛基质 、 PH7.2尿素酶、KCN 、 赖氨酸脱羧酶,硫化氢（H2S）试验,挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。 培养基底部呈黑色，为阳性，记+ 培养基底部无黑色，为阴性，记-,三糖铁培养的培养,典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征： 表面（-）粉红色、底层（+）黄色、
9、H2S （+）底层有黑色、有动力。 在TSI培养基中：表面（+）黄色、 H2S （-）的培养物可排除，其它培养物均有可能是沙门氏菌。,靛基质试验,靛基质+,尿素酶试验,阳性,赖氨酸脱羧酶试验,取待检菌，分别接种于含有赖氨酸的培养基内和不含赖氨酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。 试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 + 试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。,氰化钾试验,取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。 对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。 对照管有菌生长，试验管无
10、菌生长为阴性。记-。,（2）、典型沙门氏菌的五项生化反应及其检验的利用,A、典型五项生化反应：A1 H2S（+） 靛基质（-） PH7.2尿素酶（-） KCN（-） 赖氨酸脱羧酶（+） 如尿素、KCN、赖氨酸脱羧酶有1项异常，按表判定,B、利用五项生化反应鉴定沙门氏菌的最简单方案,a、五项生化反应：A2 H2S（+） 靛基质（+） PH7.2尿素酶（-） KCN（-） 赖氨酸脱羧酶（+），补做甘露醇和山梨醇试验，均为阳性为沙门靛基质阳性变体，需结合血清鉴定结果。 b、五项生化反应：A3 H2S（-） 靛基质（-） PH7.2尿素酶（-） KCN（-） 赖氨酸脱羧E（+/-），补做ONPE试验，
11、ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌 必要时进行沙门氏菌生化菌群鉴别,5、血清学试验（最后鉴定）,（1）、沙门氏菌诊断血清的种类： 10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴定 26种组合血清：常见致病菌的定群与分型 57种组合血清：常见定型，初步鉴定AF群以外的菌型 144种组合血清：全套装,（2）、血清学检验步骤,抗原准备 AF多价血清检验（判定是否是沙门氏菌） 群特异性抗体血清（如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别） O单因子血清检查 H因子血清检查（分型） 报告,五、检验结果的报告,1、凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告检出沙门氏菌。
12、经检验，报告25 g（mL）XX食品中检出沙门氏菌 2、凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告XX食品中未检出沙门氏菌。,思考题：,1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？ 2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？ 3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？ 4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，AF群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？,5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗原血清学试验。 6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如何，说明其原理。 7、分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初
13、步鉴定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。 8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。,第三节、志贺氏菌的检验,一、生物学特性 （一）、形态与染色 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛 23um*0.50.7um,（二）、培养特性,1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37，PH7.27.4 2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落 3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。,（三）、生化反应,1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。 2、不发酵侧金盏花
14、醇、肌醇、水杨苷。 3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性。,（四）、抗原结构,1、抗原构成： O抗原： 群特异性抗原：A、B、C、D K抗原：除B群外，一般有K抗原,2、志贺氏菌的分群与血清型,志贺氏菌分为四群： A群（痢疾志贺氏菌）：110型 B群（福氏志贺氏菌）：16型+X、Y两个变种， C群（鲍氏志贺氏菌 ）：115型 D群（宋内氏志贺氏菌） ：1个型,志贺氏菌属抗原的分类,葡萄糖+,乳糖-,甘露醇-,痢疾志贺氏菌1、3、4、5、6、9、10型,痢疾志贺氏菌2、7、8型,福氏6型，鲍氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型,福氏痢疾菌（
15、1、2、3、4、5型）鲍氏5、7、9、11、13、15型,靛基质-,乳糖+,宋氏志贺氏菌,靛基质-,靛基质+,靛基质-,靛基质+,甘露醇+,3、属内外抗原关系,（1）群内抗原关系： A群：2与10型，具有密切关系 C群：1与4和11型，10与11相关 B群：群抗原是B群各型之间的共同抗原 （2）群间抗原关系： C群17型与A群3型相关 C群18型与A群11型相关,（3）属外抗原关系： 志贺氏菌与埃希氏菌属的O抗原关系非常密切，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏希菌的O抗原关系未见报道外，每一个型都与一定的埃希氏菌的O抗原有关。,4、K抗原对O抗原血清学试验的影响 可阻碍O抗原的血清学凝集试验，煮沸处
16、理即可。,（五）志贺氏菌的抵抗力,志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。 一般在潮湿土壤中能存活34天，37水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-6010分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。,二、志贺氏菌的致病性与食物中毒,（一）流行病学,传染源,食物、病人、粪便、苍蝇等,（二）志贺氏菌的致病性,致病因素： 侵袭力、菌体内毒素、外毒素,（二）临床症状,A、急性细菌性痢疾： 急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。 B、慢性细菌性痢疾： 慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。,三、微生物检验,（一）检验步骤（程序） 检样样品处理
