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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：丕! 盏日期：! ! ! ：! ：毒。 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权
2、单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 荔嘉 指导教师签名：妄聋碉终 日 期： 丝I 立2 ：! ! 4 0 q s I 目录 摘要 中文论著摘要1 0 00 101O I O l 英文论著摘要0 Q 00 00 3 论文 前言6 实验方法6 结果1 3 讨论1 4 结论1 4 本研究创新性的
3、自我评价Q O Q O IO O Q O IO 1 6 参考文献1 7 附录 综j 苤1 8 在校期间科研成绩1 1 0 0 0 O QO0 2 6 致谢2 7 个人简历2 8 ， ， ， ， ， 一 二 三四五 中文论著摘要- C D 3 1 与C D 3 4 在肺腺癌中的表达及临床意义 目的 探讨C D 3 1 与C D 3 4 在不同分化程度的肺腺癌中的表达情况，并且与淋巴结 转移之间的关系，以及肺癌旁微血管密度的情况。 方法 一、材料 收集中国医科大学附属盛京医院肺腺癌切除手术病人石蜡组织标本，术前均 未接受放疗或化疗，共9 0 例。其中高分化：2 8 例，中分化：3 4 例，低分化：
4、2 8 例，有淋巴结转移4 4 例，无淋巴结转移：4 6 例。 二、试剂 即用型C D 3 1 、C D 3 4 单克隆抗体( 北京中杉金桥公司) 、即用型D A B 显色液 ( 北京中杉金桥公司) ，P B S ( 磷酸盐缓冲液) ，D A B ( 3 ，3 。二氨基苯联胺) ，二甲苯， 梯度酒精，3 双氧水，5 牛血清蛋白，链霉素抗生素过氧化物酶溶液，生物素 标记的第二抗体等。 三免疫组化检测 采用免疫组化S A B C 法分别检测C D 3 1 与C D 3 4 在肺腺癌高分化、中分化、 低分化的表达情况，用生物素标记的第二抗体作为阴性对照。 四、结果判定 应用显微照相系统进行图像采集，
5、C D 3 1 与C D 3 4 阳性反应物为浅棕至深棕色 颗粒，分布在血管内皮细胞。微血管计数方法，根据W e i d n e r 方法，首先在低倍 镜下( 5 ) 扫描，寻找肿瘤内清楚的血管染色，且微血管密度最多的区域，然后 在2 0 0 倍物镜下计数肿瘤内、肿瘤与正常组织交界处的毛细血管和小静脉数目， 任何呈棕黄色的阳性内皮细胞或内皮细胞簇且与邻近血管、肿瘤细胞和其它结缔 组织成份清楚分开即为一个能够计数的微血管，因为计数微血管的方法在观察者 之间或观察者本人存在着差异，所以在不同的时间计数三次，选择两次相同或相 近数目的平均数。 五、统计学分析 采用S P S S l 6 0 软件对数
6、据资料进行分析，计数资料用检验进行分析，检验水 准i x = 0 0 5 实验结果 C D 3 4 与C D 3 1 抗体显示有淋巴结转移的血管数分别是2 5 6 士3 8 和 2 1 3 + 3 2 ，无淋巴结转移的血管数分别是2 2 2 - d ：3 3 和1 9 1 + 3 5 。C D 3 4 比C D 3 1 更 敏感，能突出显示较小的、不成熟的微血管或单一的内皮细胞，并且有转移肺腺 癌的微血管数显著高于无转移肺腺癌的微血管数( P 3 5 ，为唾液酸化位点集中区，丰富的链 糖能保护C D 3 4 分子免受某些蛋白酶水解，以维持其结构的稳定，并可提供特异 性识别位点。跨膜区含有2 2
7、 个疏水氨基酸残基，是1 个跨膜的螺旋结构，具有i 型跨膜蛋白的特征。胞浆区由7 3 个疏水氨基酸残基组成 2 1 ，配基被调节蛋白c r k ? l 识别，在诱导细胞聚集中亦发挥一定作用【3 1 。 C D 3 4 ，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干祖细胞表面，并随细胞 1 9 的成熟逐渐减弱至消失。目前已有愈来愈多的研究结果表明c d 3 4 分子在介导细胞 问黏附作用中发挥着重要作用，可以参与造血干细胞的运输、定植，参与炎症。 另外C D 3 4 是泛血管内皮标记物之一，应用广泛，被认为是重复性好、稳定性高，较成 熟的血管内皮标记物，作为常规指标应用于多种恶性肿瘤的免疫组化检测。恶
8、性 肿瘤生成依赖血管形成，了解肿瘤组织内C D 3 1 ，C D 3 4 等泛血管内皮细胞标记物的 表达可明确肿瘤微血管形态、分布、数量及血液循环等特性变化，对肿瘤的形成 机制、治疗和预后判定有着重要的意义。 1 5 C D 3 4 分子介导黏附作用 C D 3 4 分子于1 9 8 4 年被美国科学家e i v i n 发现，属于钙黏蛋白家族，其结构包 括胞外区、跨膜区、胞浆区3 部分。作为一种黏附分子，C D 3 4 分子选择性地表达 于人类及其他哺乳动物造血干祖细胞( h e m a t o p i e t i c s t e m p r o g e n i t o rc e l l ，
9、h s e h p e ) 表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失( 4 ) 。细胞间的黏附是由多种机制和因素参 与的复杂过程，在多细胞生物个体的演化过程、细胞调节、组织生理学以及疾病 发生中都有着至关重要的作用黏附分子以受体一配体结合的形式发挥作用，参与 细胞的识别、活化和信号转导、细胞的增殖与分化、伸展与移动，是免疫应答、 炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理病理过程 2 、C D 3 1C D 3 4 在其它部位的肿瘤表达情况 近年来应用C D 3 1 ，C D 3 4 ，等新的血管内皮细胞标志物等对乳腺癌、肝癌、肺 癌、直肠癌及骨肉癌等肿瘤内M V D 的计数研究都证实：肿
10、瘤内M V D 与肿瘤预后 关系极为密切肿瘤组织内M V D 可作为部分肿瘤的化、分级和评价预后的一项 有价值指标。 2 1C D 31C D 3 4 在宫颈癌的表达情况子宫颈癌主要为鳞癌，其转移方式大多 为向邻近组织直接侵袭蔓延和经淋巴道转移，其转移机制十分复杂，受到多种相 关基因及细胞因子的调控用。CD3 1 ，CD3 4 单克隆抗体免疫组织化学染色标记 宫颈鳞癌，均能清晰地选择性地显示肿瘤间质的血管内皮细胞或内皮细胞簇，微 血管大小，形态差异较大，部分无明显管腔或管腔不规则，而肿瘤细胞和其它正 常组织不着色。癌巢及癌细胞密集区，MVD 显著少于癌周区及增生活跃区，而 且转移癌巢与坏死组织
11、之间血管生成较多，坏死区血管被破坏【5 1 。有转移宫颈鳞 癌的M VD 均明显高于无转移宫颈鳞癌的MVD ，两组间差异有非常显著性。即 原发性宫颈鳞癌的新生血管生成与转移密切相关，肿瘤中血管生成扩大了血管内 皮的表面积，增强了肿瘤进入微循环的趋势，M V D 可以作为预测宫颈鳞癌预后的 可靠指标【6 】。 2 2C D 3 1C D 3 4 在大肠癌的表达情况大肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤之一， 在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中，血管的生成是一个不可缺的环节，它不仅为肿瘤 细胞提供血供，而且也是其转移的重要途径。在大肠癌研究中，通过C D 3 1 和C D 3 4 两种内皮标记物，证实这两种血
12、管内皮标记物标记的M V D 无明显差异。从镜下 观察C D 3 4 比C D 3 1 更敏感，能突出显示较小的，不成熟的微血管或单一的内皮细 膨7 1 。大肠癌组织中C D 3 1 和C D 3 4 的表达明显高于癌旁正常黏膜。在有淋巴结 转移的肿瘤组织微血管数量显著高于无淋巴结转移组织，表明大肠癌组织内血管 生成与肿瘤转移密切相关，微血管数量越多，转移的机会越大，C D 3 1 与C D 3 4 与 大肠癌患者预后相关。K i 6 7 与大肠癌肿瘤血管生成密切相关，因此M V D 与Ki 6 7 在大肠癌的发生与转移过程中起着非常重要的作用【8 】。 2 3 、C D 3 1C D 3 4
13、 在乳腺癌的表达情况 近几年乳腺癌的发病率正在逐年上升，乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生 问题。女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在 乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中9 9 发生在女性，男性仅占1 。乳腺癌家 族史是乳腺癌发生的危险因素，近年发现乳腺腺体致密也成为乳腺癌的危险因素。 一些研究表明乳腺癌的临床分期、组织学级别、组织学类型及预后和其癌组织 内M V D 均有相关性【9 】。乳腺癌腋窝淋巴结转移组C D 34 ，CD3l 标记的血管计 数较无腋窝淋巴结转移组明显增高有显著性差异，提示上述2 种内皮细胞标记 物标记已乳腺癌肿块内M V D 具有一致性，都
14、与淋巴结的转移密切相关。腋窝淋 巴结转移的乳腺癌能量多普勒超声检测到的血管与C D 3 和C D 34 标记的血管均 显著高于无腋窝淋巴结转移者，说明在淋巴结转移前就出现了有利于肿瘤转移的 微环境【1 0 1 。 2 4 、C D 3 1 C D 3 4 在肝癌的表达情况 原发性肝细胞癌0 t C C ) 在全球的恶性肿瘤中发病率占5 位，死亡率占第3 位， 2 1 是居我国第2 位的肿瘤死亡原因，在我国每年死于H C C 的患者达3 0 万左右。原 发性肝癌在发生发展中伴随着不同阶段的癌基因或抑癌基因变异，引起相关因子 表达的紊乱【l l 】。基因在肝癌发病中可能起重要作用，除某些特殊的致病
15、基因已被 发现，引起肝癌的分子机制迄今仍不明确，对肝癌易感基因的研究是近年来肝癌 遗传机理研究的重点和热点。C D 3 1 属于黏附分子免疫球蛋白超家族的主要成员， 主要在血管内皮细胞和血小板上表达。血小板与肿瘤细胞相互作用后释放的活性 物质，可激活肿瘤细胞与血管内皮细胞的结合，促使C D 3 1 黏附于肿瘤细胞和血 管内皮细胞，在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用【1 2 1 。C D 3 1 基因L e u l 2 5 V a l 多 态性和V a l - - S e r A r g 基因单倍型与肝癌的发病可能具有相关性：而C D 3 1 基因 A s n 5 6 3 S e r 和G l y 6 7 0 A r g 多态性与肝癌的发病可能无相关性。其中V a l 等位基因可 能是肝癌的遗传易感基因，携带V a l 等位基因的个体可能通过促进C D 3 1 的高度 表达进而增加肝癌的发病风魁1 3 】。 C D 3 4 抗原阳性细胞主要位于H C
