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1、华中科技大学硕士学位论文 I 摘摘 要要 h2亚基（KCNMB2）是大电导型、电压依赖和Ca2 激活钾离子通道（BK或 Maxi-K）的辅助亚基之一，对该通道的动力学特性和药理学特性有重要的调节作用。 h2主要分布于嗜铬细胞和脑部组织。近年来，人们对其失活特性、Ca2 敏感性和门 控调节特征的研究较为详尽，但是有关h2蛋白的构象、特别是上膜机制和调节机制 仍然不清楚。 本文以分子生物学为基本手段，通过免疫荧光和膜片钳等技术手段对h2亚基胞 外部分的构象和上膜机制进行了详尽的研究，并在此基础上展开了有关h2对BK通 道门控调节机制的研究。主要结果如下： 1）在由h2亚基与亚基（mslo）装配的B
2、K通道中，h2亚基137位氨基酸残基 附近的区域可能是该亚基胞外区段唯一可以被免疫荧光检测到的区域，而且此段区 域靠近BK通道孔区，直接影响通道的电流特性。因此137位点的发现为后续h2亚基 转运和调节机制的研究奠定了基础。 2） 我们发现： 当h2与mslo共表达时， h2亚基将与亚基组装并一起转运上膜； 而当h2单独表达时，将会滞留在内质网中而不能上膜。说明h2亚基可能由于自身 存在内质网滞留信号，只有与亚基装配成功后才能转运到细胞膜。 3）我们发现并证明了h2的滞留信号位于其NH2端，是由五个氨基酸残基 （QKIRD）组成的基本序列。并且有关h2 NH2端（胞内部分）溶液核磁共振试验的
3、结果表明，该序列是一段螺旋的核心。去掉或者破坏此段核心螺旋将使滞留信号减 弱或消失。说明五个氨基酸的基本序列所形成的二级结构在h2亚基滞留过程中发挥 了重要作用。 4）我们研究并描绘出了h2亚基胞外区域（loop）的大致空间结构，并发现该 区域137位及其附近的带正电荷氨基酸残基 （K） 可能在BK通道外口形成了正电荷环， 使BK通道产生外向整流特性。 关键词：关键词：BK通道 亚基 转运机制 滞留信号 外向整流 本研究课题得到国家自然科学基金（基金号：30470449，30025023 和 20132030）的 资助。 华中科技大学硕士学位论文 II Abstract h2 (KCNMB2)
4、 subunit is one of the auxiliary subunits of the large conductance voltage dependent and Ca2 activated potassium channel(BK or Maxi-K), which plays an important role in modulating the kinetics and the pharmacological properties of BK channels. This subunit is mainly expressed in chromaffin cells and
5、 brain. At present, much about the inactivation, Ca2 sensitivity and regulatory of gating properties of h2 subunit have been studied. However, the conformation of the transmembrane protein, especially the trafficking mechanism and the regulatory mechanism of gating are still unknown. In this study,
6、by means of molecular cloning, and with the help of immunofluorescence and path-clamp techniques, we have determined the conformation and the trafficking mechanism of h2. Further more, we have studied the regulatory mechanism of gating of h2. The main results of this study are shown as follows. 1. B
7、K channels that assemble of h2 and subunit (mslo), the region flanking the 137 amino acid of the extracellular loop of h2 may be the only one domain that could be detected by immunofluorescence. This extracelluar region resides very closely to the outer pore of the channel. The discovery of this imp
8、ortant region opens possibility for the further study of the trafficking and regulatory mechanism of this subunit. 2. When coexpressed with mslo, h2 will transport to the membrane, while expressed alone h2 will reside in the ER (endoplasmic reticulum), revealing that h2 may contains a retention sign
9、al that prevent its membrane expression. 3. We then have demonstrated that the retention signal is located at the NH2 terminus of h2. It is a motif consisting of five amino acids QKIRD. The motif is the core of helix which is crucial for the retention process. Deletion or disruption of this core wil
10、l decrease or get rid of the rentention signal. 4. We have studied the extracellular loop of h2 and described the probably conformarion of the loop. The positive charged residues around position 137 of the extracellular loop may form a positive charged ring which makes BK channels possess the proper
11、ty of outward rectification. Key words: BK channel,subunit, trafficking mechanism, retention signal, outward rectification This work was supported by National Science Foundation of China grants (30470449, 30025023 and 20132030). 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论
12、文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“”
13、） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华中科技大学硕士学位论文 1 1 绪绪 论论 离子通道的结构与功能研究是生命科学交叉领域中最活跃的分支之一。在离子 通道中，钾通道是一个最庞大的家族。钾离子通道是唯一的平衡电位在典型的细胞 膜静息电位附近的离子通道，这一特性使得它在维持细胞膜静息电位的过程中发挥 决定性的作用。钾通道特别是电压门控钾通道研究近些年来在三维结构研究方面取 得了令人振奋的进展，使该领域再次成为离子通道研究的热点，并推动着整个神经 及相关学科的基础和应用研究的发展。 本章主要讨论钾通道家族的一个重要的亚家族BK 通道（Maxi
14、-K 或 slo 通 道） 。BK 通道因其非常大的单通道电导特性而与众不同，控制着极其多样的生理过 程，包括平滑肌收缩、神经递质分泌和听觉的产生等。辅助亚基与 slo 自身的剪切 以及代谢调节构成了 BK 通道丰富的多样性， 这也是 BK 通道在众多不同的组织中行 使恰当功能的基础。 1.1 钾离子通道研究概况钾离子通道研究概况 1.1.1 钾通道的离子选择性钾通道的离子选择性 到目前为止，有超过 80 个钾离子通道哺乳动物基因被克隆。尽管不同类型的钾 离子通道构造非常不同，但是它们仍然能够以一个共同的特征加以识别：所有的钾 离子通道都具备孔区一致序列-TXXTXGYGD- （-thr-X-
15、X-thr-X-gly-tyr-glu-asp-其中 X 代表任意一个氨基酸残基） 。该一致序列也叫指纹序列1。TXGYG 在通道孔区重复 出现构成了钾通道的选择性离子过滤器，这也是钾离子直径虽然大于钠离子，但钾 通道却只允许钾离子通过，而不允许钠离子通过的根本原因。选择性过滤器决定着 离子选择的特异性，其有 4 个钾离子的结合位点。指纹序列位于第 5、6 跨膜的 螺 旋之间的孔道区内。钾离子在进入通道前被 8 个水分子包围。为了穿过选择性过滤 器，钾离子必须摆脱水分子的束缚。进入通道的每一个钾离子首先受到指纹序列氨 基酸残基中的 8 个氧原子的包围。8 个氧原子包围一个钾离子，完美地取代了水
16、分子 华中科技大学硕士学位论文 2 层。脱水后的钾离子沿着孔道从一个部位移到下一个结合的位点。一旦钾离子通过 选择性过滤器后，它又重新被水分子包裹。钠离子不易通过钾离子通道的原因是钠 离子无法与通道内衬的氧原子相互作用2-6。 1.1.2 钾通道的门控机制钾通道的门控机制 除了离子作用外，氨基酸的结构对于钾通道的选择性也至关重要，这就是钾通 道的门控机制。钾通道主要由 4 个 shaker 糖蛋白（4 个亚单位）构成。钾通道的 NH2 末端（氨基末端）是控制快速失活的多肽段，其快速失活（通道关闭）发生的时间 通常在毫秒级水平。 国外学者 Zagotta 等描述的钾通道快速失活分子机制的“球-链”学说为后来出 现的相关学说奠定了基础。这一学说的基本内容是：钾通道的游离 NH2末端（特别 是前 20 个氨基酸）在细胞内为球-链状结构，在通道从关闭到迅速开放的同时，NH2 末端的“球-链”
