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1、呼吸系统疾病 动物模型,2010342062 石晓征,呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死。在城市的死亡率占第位，而在农村则占首位。更应重视的是由于大气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺病（简称慢阻肺，包括慢性支气管炎、肺气肿、肺心病）、支气管哮喘、肺癌、肺部弥散性间质纤维化，以及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减。,咳嗽动物模型 支气管哮喘动物模型 慢性支气管炎模型 肺气肿和肺心病动物模型 肺水肿动物模型 肺纤维化动物模型 肺结核病动物模型 肺硅沉着症动物模型,
2、第一节 咳嗽动物模型,咳嗽是呼吸系统多种疾病的常见症状。确定受试药物的镇咳作用,可采用小鼠氨水或二氧化硫引咳法及豚鼠枸橼酸引咳法两种模型加以确定, 并与阳性药物进行同步观察。,豚鼠是筛选镇咳药(antitussives)的常用动物。小鼠和大鼠给予化学刺激虽然能诱发咳嗽，但其咳嗽与喷嚏动作很难区别，变异较大，特别是反复刺激时变异更大，故小鼠主要作为初筛镇咳药时使用。,一、小鼠氨水引咳法 造模原理 浓氨水是一种较强的化学刺激物，动物吸入氨水气雾后，刺激呼吸道感受器，引起咳嗽。 动物和主要器材 成年小鼠,性别不拘。500ml玻璃罩; 空气压缩机(或脚踏风箱)。,操作步骤 1.小鼠置玻璃罩内空气压缩机
3、以400mmHg恒压将氨水喷入罩内喷雾5s记录动物咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数。也可用引起一半小鼠咳嗽的喷雾时间(FDT50)为指标。,2.观察药物的止咳作用 小鼠按体重均分3组，每组至少15只小鼠。给药组灌服受试药，模型组灌服等体积生理盐水，阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因30mg/kg体重。灌胃给予受试药1 h后、腹腔注射给予受试药30min后开始喷雾。喷雾一定时间，终止喷雾，观察咳嗽反应。,模型评价与注意事项 1.氨水诱发小鼠咳嗽反应变异性较大,可在初筛止咳药时应用。 2.咳嗽潜伏期是指从喷入氨水开始至发生咳嗽所需的时间(秒数)。小鼠咳嗽以腹肌收缩(缩胸)，同时张大嘴为准，有时可有咳嗽声
4、，观察必须仔细，也可用听诊器听咳嗽声。,3.避免腹腔注射给予受试药,以免干扰动物的咳嗽反应。,二、小鼠二氧化硫引咳法 造模原理 二氧化硫是一种强的化学刺激物质,动物吸入其气雾后刺激呼吸道感受器,反射性引起咳嗽。无水亚硫酸钠与硫酸反应生成SO2。,操作步骤 用一带侧口的三角烧瓶,侧口通过橡皮管与球囊连接,烧瓶内盛有无水亚硫酸钠,烧瓶塞上装一滴定管,内灌硫酸，打开滴定管的活塞使硫酸滴到亚硫酸钠上，在烧瓶内产生SO2气体，气体储存于球囊内，用血管钳夹紧，应用时用注射器吸取410ml，注入放置实验小鼠的广口瓶内。,3.观察药物的止咳作用 小鼠按体重均分3组，给药组灌胃给予受试药，模型组灌胃给予等体积生
5、理盐水，阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因30 mg/kg体重。灌胃给予受试药1 h或腹腔注射给药30 min后，将小鼠置于充满SO2的烧杯内，观察咳嗽潜伏期，按下式计算药物止咳率： 给药组咳嗽潜伏期 药物止咳率（%） 100% 模型组咳嗽潜伏期,注意事项 1.烧杯内SO2的浓度要求在1:50000，该浓度足以引起咳嗽，如浓度过高(如1:10000)易造成动物中毒死亡。 2.实验中SO2产生的多少与实验室温度、无水亚硫酸钠的量关系密切，故无水亚硫酸钠的称量应准确。,3.SO2引咳的个体差异较大,实验时应尽量减少各方面误差。,三、豚鼠枸橼酸引咳法 造模原理 豚鼠吸入枸橼酸溶液喷雾后，刺激呼吸道粘膜感
6、受器，反射性引起咳嗽。 动物和主要器材 体重200250g豚鼠。 24L玻璃罩; 空气压缩机。,豚鼠体型短粗而圆，头较大，眼大而圆还明亮，耳圆，上唇分裂，耳朵短小；四肢短，前脚具4趾，后脚3趾，无外尾。,操作步骤 1.将豚鼠置于玻璃干燥器内,用超声雾化器喷入17.5%枸橼酸雾化气510s，观察、记录豚鼠咳嗽潜伏期或记录5min内豚鼠的咳嗽次数。,2.观察药物的止咳作用 将豚鼠按体重随机分为3组,给药组灌胃给予受试药,模型组灌胃给予等体积生理盐水,阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因5mg/kg体重。灌胃给予受试药1 h或腹腔注射给药30min后，按上述方法引咳,评受试药的止咳效果。,模型评价与注意事
7、项 1.豚鼠对化学性刺激物很敏感,刺激后能诱发咳嗽,动物容易得到。二氧化硫引咳法、氨水引咳法和枸橼酸引咳法是研究止咳药的三种常用方法，前二者系用小鼠，费用较低廉，适合于研究止咳药效果的初筛，确定效果后，再用豚鼠作进一步研究。,2.豚鼠的咳嗽声响亮，应以能听到声音为咳嗽。 3.实验前1日豚鼠应预先挑选，喷雾后5 min内咳嗽次数少于10次者应予以淘汰。,第二节 支气管哮喘动物模型,支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘，是气道的一种慢性变态反应性炎症性疾病。哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症，由此导致患者的气道高反应性（气道对各种刺激因素出
8、现过强或过早的收缩反应），造成气道缩窄，气流受阻。,临床上表现为反复发作性喘息、呼气性呼吸困难和胸闷等症状。哮喘是一种常见疾病，全球约有1亿5千万，我国约有1千5百万哮喘病人，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。,哮喘的发病机制尚不完全清楚，有许多因素参与。过去认为哮喘是IgE介导的I型超敏反应性疾病，目前认识到哮喘是以气道高反应性为主要特征的慢性气道炎症性疾病。哮喘发病分为速发相和迟发相两个阶段。,速发相阶段:肥大细胞是主要效应细胞，致敏抗原与肥大细胞表面IgE抗体结合。当相同抗原再次进入机体后，引发肥大细胞脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺等炎症介质，导致支气管痉挛、气管粘膜微血管通透性增加、气管
9、粘膜水肿和粘液分泌亢进。 迟发相反应:特征是大量嗜酸性粒细胞局部浸润。,一、过敏性哮喘模型 造模原理 过敏性哮喘(allergic asthma)的发病机制涉及引起过敏的抗原。抗原一般具备两种特性： 一是免疫原性，即能刺激机体产生免疫应答，包括特异性抗体和致敏T细胞； 二是抗原性，系指能与抗体或致敏T细胞在体内外发生特异性结合。,过敏性哮喘模型的复制需要致敏和激发两个步骤。动物以卵清蛋白(ovalbumin，卵白蛋白)为致敏的抗原(有时并用免疫佐剂如氢氧化铝、灭活百日咳杆菌菌苗等)，经腹腔或皮下注射，刺激机体产生IgE，并结合在肥大细胞等细胞表面，使机体处于致敏状态。,一定时间后当动物再次接触
10、到相同抗原后，发生I型速发型过敏反应，呼吸道粘膜肥大细胞等合成并释放多种生物活性物质，引起支气管平滑肌收缩、粘液分泌增多、血管通透性增高和炎症细胞浸润等(激发)，导致哮喘发作。,(一)腹腔注射致敏剂豚鼠模型 动物、试剂与器材 体重250300g豚鼠，雌雄不限。10%和0.5%1%卵清蛋白生理盐水溶液；超声雾化器。,操作方法 1.致敏 腹腔注射10%卵清蛋白生理盐水溶液1.0ml（含卵清蛋白100mg）使豚鼠处于致敏状态。 2.激发 注射卵清蛋白后2周，将豚鼠置于密闭有机玻璃箱内，用0.5%1%卵清蛋白生理盐水溶液超声雾化吸入30s2min，诱发豚鼠哮喘发作。 3.支气管-肺泡灌洗。,结果及模型
11、评价 1.豚鼠可出现气喘表现，咳嗽、烦躁、口唇和四肢紫绀，呼吸费力挣扎，呼吸频率加快和呼吸加深。病理检查可发现肺毛细血管扩张、嗜酸性粒细胞浸润和腺体分泌亢进。 2.豚鼠是能最好显示气道高反应性的动物，其哮喘发作与人类的表现相似。,3.用于复制过敏性哮喘动物模型的抗原物质主要有卵清蛋白、蛔虫卵、尘螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂等。卵清蛋白为蛋清提取物，免疫原性强，来源方便，价格低廉，最常用于复制哮喘模型。,4.卵清蛋白激发豚鼠哮喘发作是目前国内外常用的方法，操作简单，可重复性强。本模型主要用于哮喘发病机制研究和治疗效果观察。动物每日引喘1次，反复1014d，可成为哮喘慢性发作模型。,5.本模型最大
12、的缺点是豚鼠对卵清蛋白反应的个体差异很大，少数豚鼠可能不出现哮喘反应，而一些动物则可发生急性过敏性休克。,注意事项 1.宜选用等级高、溶解性好的卵清蛋白。 2.超声雾化器应气雾流量较大、雾化颗粒较小。 3.激发用的抗原量和吸入时间非常重要，雾化吸入的卵清蛋白溶液必须用较低浓度，以减少动物死亡。,4.动物一旦出现腹肌明显收缩，应立即将其移出有机玻璃箱，以免因窒息而死亡。,二、哮喘离体实验方法 (一)豚鼠气管片法,基本原理 将制备的气管片置于盛有营养液的恒温浴槽内,加一定负荷,通过拉力换能器,将致痉剂或受试药对气管作用所产生的张力转换为电信号,放大后由记录仪描记出标本的舒缩曲线,可反映大气道的舒缩
13、变化。,取出气管, 制备气管片,制备气管螺旋条,连接到描记装置 供氧的离体器官浴槽内,观察药物作用 加组胺或乙酰胆碱气管条张力达到最高点时,分别加入不同剂量受试药,记录气管条张力变化.求受试药的解痉百分率 给药前曲线高度给药后曲线高度 解痉百分率（%） 100 给药前曲线高度,第三节 慢性支气管炎模型,慢性支气管炎(chronic bronchitis,简称慢支)是指气管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床上以反复发作咳嗽、咳痰或伴有喘息症状为特征,且症状每年至少持续3个月,连续两年以上。病情持续多年者常并发肺气肿和慢性肺心病。,慢支的病因和发病机制较复杂，是由多种因素长期综合作用
14、所致。已确定的致病因素包括细菌和病毒感染、吸烟、空气污染、过敏和机体内在因素等。,一、大鼠烟熏模型 造模原理 烟雾中含有许多有害物质,如焦油、CO、尼古丁及氧化物等,它们随烟雾被吸入支气管,抑制粘膜上皮细胞的纤毛运动,刺激分泌增加,降低巨噬细胞的吞噬功能而有利于感染。随着烟雾刺激时间的延长,气管炎症逐渐加重,一般在21d后开始出现呼吸道慢性炎症,约至第7周可形成慢性支气管炎的典型病理变化。,操作方法 成年雄性大鼠。将大鼠置于27m3烟室内,吸入混合烟150200mg/m3(200g锯末,1520g烟叶,67g干辣椒及1g硫磺混合,2030 min内烧化,颗粒在0.51m以上)，每周吸入6次,4
15、4d后即可形成慢性支气管炎病变。,第四节 肺气肿和肺心病动物模型,阻塞性肺气肿(简称肺气肿)是呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡因过度充气呈持久性扩张，并伴有肺泡间隔破坏，肺组织弹性减弱，导致肺体积膨大、功能降低的病理状态。肺气肿常继发于其他肺阻塞性疾病，尤以慢性支气管炎最为常见。,肺气肿发病机制与慢性支气管炎引起的呼吸道阻塞(特别是小气管)、体内-抗胰蛋白酶或-巨球蛋白缺乏、遗传因素、变态反应等有关。目前复制肺气肿动物模型的主要方法有利用弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、氯化镉、饥饿、吸烟诱发肺气肿和转基因肺气肿模型等。,肺源性心脏病(cor pulmonale，简称肺心病)是呼吸系统的常见病，是指
16、由支气管-肺组织、胸廓或肺动脉病变引起肺血管阻力增加，产生肺动脉高压等多种因素的心脏病。根据起病的缓急和病程长短，可分为急性和慢性两种，以后者为多见。,一、弹性蛋白酶诱发兔肺气肿模型 造模原理 肺组织中参与肺泡壁降解的蛋白酶主要是弹性蛋白酶(elastase)。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子(主要为-抗胰蛋白酶)失平衡可能在肺气肿发生中起一定作用。,在正常情况下,弹性蛋白酶抑制因子可以抑制此酶的活性,使弹性蛋白酶与弹性蛋白酶抑制因子之间处于平衡状态,维持肺组织正常结构,避免肺气肿的发生,但当弹性蛋白酶活性过强时可造成肺气肿。,本模型主要基于肺气肿形成的弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子之间的失平衡学说。弹性蛋白酶注入肺内后,穿越肺泡上皮细胞进入肺间质,降解弹性纤维, 从而形成肺气肿。,操作方法 体重2.53.0 kg雄
