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1、第六章 质谱技术与质谱仪,赵进郑州大学,蛋白质组学技术平台,一、概述,1、质谱仪的发展史1912年:世界第一台质谱装置40年代: 质谱仪用于同位素测定50年代：分析石油60年代：研究GC-MS联用技术70年代：计算机引入80年代：研究LC-MS联用技术90年代：研究蛋白质分析技术,2、质谱的概念,质谱分析法（Mass Spectroscope,MS）是将化合物形成离子或碎片离子，按质荷比(m/e)的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。质谱（mass spectrum，MS）是将带电原子、分子或分子碎片按其质量或质荷比（m/e）大小顺序排列而成的图谱。,质谱仪（mass spec
2、trometer）是将待测物样品在一定条件下转化成气态离子并通过质量分析器，按其质量或m/e大小顺序进行分离、记录的分析仪器。,3、质谱的特点,信息量大，应用范围广，是研究分子结构的有力工具。 由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息，所以质谱法也是测定分子量的常用方法。 分析速度快、灵敏度高、高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定。 质谱仪器较为精密，价格昂贵，工作环境要求较高。,二、质谱技术的基本原理,1、进样化合物通过汽化引入离子化室；,2、离子化在离子化室，组分分子被一束加速电子碰撞（能量约70eV），撞击使分子电离形成正离子；M M+ + e或与电子结合，形成负离子M
3、+ e M,4、荷电离子被加速电压加速，产生一定的速度v，与质量m、电荷e及加速电压V有关，其动能与加速电压及电荷遵循,5、加速离子进入一个强度为H的磁场，发生偏转，半径为：,二、质谱仪的基本结构,质谱仪的分类,质谱的结构,（一）真空系统,为了保证离子源中灯丝的正常工作，保证离子在离子源和分析器正常运行，消减不必要的离子碰撞，散射效应，复合反应和离子-分子反应，减小本底与记忆效应,因此，质谱仪的离子源和分析器都必须处在高真空中才能工作，一般应在10-510-6Pa 。一般真空系统由机械真空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。,（二）进样系统,要求： 高效重复的将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降
4、低，而样品导入离子源的方式决定于样品的物理性质。方式： 1. 间歇式进样系统 2. 直接进样系统 3. 色谱进样系统（从HPLC、GC及CE）,1. 间歇式进样系统,可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液体试样引入试样储存器中。由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透进高真空的离子源。,2. 直接进样系统,对那些在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可直接引入到离子源中。通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子
5、源，可以对样品杯进行冷却或加热处理。,3. 色谱进样系统,气相色谱-质谱联用仪 从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引入质谱仪的离子化室。,液相色谱-质谱联用仪 采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样品离子进入质谱分析仪。,对于蒸汽压低的样品进行衍生化后进样例如：葡萄糖变成三甲基硅醚的衍生物,（三）离子源,质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。不同的分子离子化所需要的能量不同，因此，应选择不同的离解方式： 硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易破裂或易电离的样品。,质谱研究中的几种离子源,1. 电子轰击离子化（E
6、I）,电子轰击源是质谱通用型的电离源，硬电离方法，由此产生的图谱称为EI-MS。灯丝与接收极之间的电压为70伏，发射出能量为70eV的高能电子束，撞击来自进样系统的以气体形式进入离子源的样品分子，使样品分子电离，产生正离子，获得加速，经过狭缝进一步准直后进入质量分析器。,可在平行电子束的方向附加一弱磁场，使电子沿螺旋轨道前进，增加碰撞机会，提高灵敏度。,当电离源有足够的能量使带有较大内能时，可能进一步发生键的断裂，形成大量的各种低质量数的碎片正离子和自由基或中性分子。,由分子离子可以确定化合物分子量,由碎片离子可以得到化合物的结构。,在电子轰击下，样品分子可能有四种不同途径形成离子： （1）样
7、品分子被打掉一个电子形成分子离子； （2）分子离子进一步发生化学键断裂形成碎片离子； （3）分子离子发生结构重排形成重排离子；（4）通过分子离子反应生成加合离子；（5）同位素离子,特点： 碎片离子多，结构信息丰富，有标准化合物质谱库；不能汽化的样品不能分析，主要用于挥发性和分子量较小样品的电离；有些样品得不到分子离子。,2. 化学电离（CI）,结构与EI同，但是在离子化室充CH4，电子首先将CH4离解，其电离过程如下：,特点：得到一系列准分子离子（M+1）+， （M-1）+， （M+2）+等等；CI源的的碎片离子峰少，图谱简单，易于解释；不适于难挥发成分的分析。,3. 场电离（FI）,FI是利
8、用强电场诱发样品分子的电离，属于软电离。最重要的部件是电极，正负极间施加高达10KV的电压差，两极的电压梯度可达107108Vcm-1。若具有较大偶极矩或高极化率的样品分子通过两极间时，受到极大的电压梯度的作用（量子隧道效应）而发生电离。,特点：分子离子峰（或准分子离子峰）强度较大，而碎片离子峰很少；图谱较简单。,4. 场解吸电离法（FD）,与FI类似的有场解吸源，它把样品溶液置于阳极发射器的表面，并将溶剂蒸发除去，在强电场中，样品离子直接从固体表面解吸并奔向阴极。FD是一种软电离技术。,特点：一般只产生分子离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰极少，图谱很简单；特别适用于热不稳定性和非挥发性化合物
9、的质谱分析。,5. 快原子轰击电离法（FAB）,为了获得高动能，首先让稀有气体原子电离，并通过电场加速，然后再与热的气体原子碰撞而导致电荷和能量的转移，获得快速运动的原子，它们撞击涂有样品的金属极，通过能量转移而使样品分子电离，生成二次离子。通常将样品溶于惰性的非挥发性溶剂，并以单分子层覆盖于探针表面，以提高电离效率，而悬浮样品不适用。,属于软电离，一般用作磁式质谱的离子源。,特点：分子离子或准分子离子峰强；碎片离子也丰富；适合于热不稳定、难挥发的样品，如肽类；其缺点是溶解样品的溶剂也会被电离而使图谱复杂化。,（四）质量分析器,质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，依据不同的方式将样品离子
10、按质荷比分开。1 单聚焦分析器（single focusing mass analyzer）2 双聚焦分析器（double focusing mass analyzer）3 飞行时间分析器(time of flight）4 四极杆滤质器 (quadrupole mass filter)5 离子阱分析器 (Ion trap),1. 单聚焦质量分析器,结构：扇形磁场（可以是180 9060等）。离子束经加速后飞入磁极间的弯曲后区，飞行轨道在磁场的作用下发生偏转，分离开的离子信号由检测器检出。,设质量为m，带有电荷为e的正离子，若其初始能量为0，在离子室中受到加速电压V的作用，到达离子室的出口狭缝即
11、分析器的进口狭缝S1，离子具有的动能为:,当离子进入分析器的磁场后，受到洛伦兹力的作用而作半径为R的圆周运动，圆周运动的离心力要与洛伦兹力平衡，即：,合并以上两式，得到:,式中H为磁分析器的磁场强度,正离子的电荷数用Z表示，的相对质量单位数用M表示，H的单位为高斯（1高斯=10-4特），V的单位为伏特，R的单位为cm,V,可见，R取决与 M/Z、H、V，若仪器的H、V一定，则 ，Z一般为1，所以 ，表明磁分析器可以把不同质量的离子分离开，这叫做质量色散，而对于相同质量、以不同方向进入扇形磁分析器的离子有会聚作用，起到了方向聚焦的作用，而且仅有方向聚焦，故称为单聚焦质量分析器。 对于一定的质谱仪
12、器来说，离子源的出口狭缝S1及分析器出口狭缝S2的位置是固定的，离子收集器（检测器）的位置也是固定的，表明R是一定的。进行质谱分析是可以用固定的加速电压V而连续改变磁场强度H或固定H连续改变V，使不同的离子依次通过S2到达检测器，而获得质谱图。前者称为磁场扫描，后者称为电压扫描。,特点,单聚焦分析结构简单，操作方便但其分辨率很低。不能满足有机物分析要求，目前只用于同位素质谱仪和气体质谱仪。单聚集质谱仪分辨率低的主要原因在于它不能克服离子初始能量分散对分辨率造成的影响。,2. 双聚焦质量分析器,在单聚焦分析器中，离子源产生的离子在进入加速电场之前，其初始能量并不为零，且各不相同，表明离子源中的离
13、子有一定的能量分散。,为了消除离子能量分散对分辨率的影响，通常在扇形磁场前加一扇形电场。质量相同而能量不同的离子经过静电电场后会彼此分开。即静电场有能量色散作用。如果设法使静电场的能量色散作用和磁场的能量色散作用大小相等方向相反，就可以消除能量分散对分辨率的影响。只要是质量相同的离子，经过电场和磁场后可以会聚在一起。另外质量的离子会聚在另一点。改变离子加速电压可以实现质量扫描。这种由电场和磁场共同实现质量分离的分析器，同时具有方向聚焦和能量聚焦作用，叫双聚焦质量分析器。,离子通过静电场分析器时，由于受此电场力的作用，会改变运动方向成曲线运动，其离心力等于电场作用力，即：,式中Rc为离子在电场分
14、析器的运动曲率半径，E为分析器的电场强度。则,离子运动的轨道半径可以通过外加静电场加以控制。只有能动相同的离子才能通过中间狭缝，实现能量聚焦，然后再进行方向聚焦。,特点,双聚焦质量分析器的最大优点是大大提高了仪器的分辨率。但仪器昂贵，调整、操作、维护均较为困难。,3.飞行时间质量分析器（TOF）,TOF是一种无磁动态质量分析器，根据不同质荷比的离子在无场分离区中的速度不同，引起漂移时间的差异而实现分离。TOF有直线型或反射型等不同方式。,TOF的主要部分是一个离子漂移管。样品受到阴极灯丝发出的电子轰击后变成离子，栅极G1上的负脉冲将离子引出离子室，G1，G2间的直流电压差使离子受到加速并进入无
15、场漂移管，最终按质荷比值不同先后到达离子接收极。,1-电离室；2-电子接收极；3-阴极；4-离子接收极,离子在加速电压V作用下得到动能，则有： 1/2 mv2=eV或v=(2eV/m)1/2离子以速度v进入自由空间（漂移区），假定离子在漂移区飞行的时间为T，漂移区长度为L，则： T=L/v=L(m/2eV)1/2对于具有不同m/e的离子，在飞行管中的飞行时间差为：,可见t取决于不同离子的m/e平方根之差，对于能量相同的离子，离子的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量越小，所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子分开。适当增加漂移管的长度可以增加分辨率。,分子离子,目前，采用离子延迟
16、引出技术和离子反射技术，可以在很大程度上克服上述3个原因造成的分辨率下降。,通过离子反射技术，质量相同能量不同的离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。,TOF-MS,特点,仪器结构简单,不需要磁场、电场等；扫描速度快，可在10-5 s内观察到整段图谱；无聚焦狭缝，灵敏度很高；可用于大分子的分析（几十万原子量单位），在生命科学中用途很广。,4. 四极杆滤质器,也称四级杆质量分析器，是一种非磁性结构的动态质量分析器。由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。,
