《植物细胞制药幻灯片》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物细胞制药幻灯片（139页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第七章 植物细胞制药,这是什么？,第一节 概述,一、基本概念,悬浮培养：在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养，在此培养条件下组织化水平较低。,细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。,分生组织培养：在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。,外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切断），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药、花粉等均可为外植体进行组织培养。,器官形成：在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。（1）在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽（2）在不同部位分别形成芽和根后，再形成维管将两者连接
2、起来形成小植株。,无性繁殖系：又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性系后代，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。从无性系中又可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”。,突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞。,继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续培养多代的培养即为继代培养。,次级代谢产物：通常把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类以外的成分称为次级代谢产物，如生物碱、黄酮、帖类、有机酸、木质素等。,原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体（pr
3、otoplast），其特点是：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。,单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。,二、植物细胞培养的发展简史,19世纪，细胞学说20世纪2030年代，在胚胎培养和器官培养领域取得了一定成果30年代末40 年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系40年代末50年代，植物组织培养进入了一个崭新阶段，主要是发现了一系列植物生长调节物质在植物培养中的作用，并且提出了用植物细胞培养技术生产有用的次级代谢产物。60年代初，成
4、功制备植物原生质体，开发了全化学培养基（MS培养基）60年代70年代中叶，主要工作是开发培养基和研究培养方法7585年，主要进行了优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬紫草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商品化生产。90年代 至今，主要是集中在抗癌药物，如长春花碱、喜树碱、紫杉醇等植物培养次生代谢物生产的研究,植物是自然界中最好的化工厂目前超过100，000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4，000种新化合物的速度增加植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等,三、植物次生代谢与次生代谢产物,植物次生代谢物的获得,直接从野生植株中分离提取植物细胞
5、培养缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地植物发根培养,利用组织和细胞培养技术生产药用成分 植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。 植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量 培养周期短，有利于节约成本大规模生产,利用组织和细胞培养产生新的化合物 鸡骨常山-利血平 长春花-蛇根碱利用组织和细胞培养物转化药用成分植物细胞和组织培养物中含有催化氧化、还原、甲基化、羟基化、异构化、酯化、糖基化、羧基化、去
6、甲基化等多种反应的酶类，可使加入到培养物中的原料转化成有用的化合物。,第二节 植物细胞的形态和生理特征,一、植物细胞的形态,二、植物细胞的结构特征,三、细胞后含物 和生理活性物质,1、细胞后含物：系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类、盐类、生物碱、苷、有机酸、挥发油等。,（2）糖苷类：,（1）生物碱：生物体内的碱性含氮有机化合物，具环状结构，难溶于水，与酸可形成盐，有一定的旋光性与吸收光谱，大多有苦味，呈无色结晶状，少数为液体。生物碱有几千种，由不同的氨基酸或其直接衍生物合成而来，是次级代谢物之一，对生物机体有毒性或强烈的生理作用。毛莨科黄连根茎中的小蘖碱是黄连素的主要成分，有抗菌消炎作
7、用；萝芙木中的利血平能降血压；石蒜中的加兰他敏对小儿麻痹后遗症有疗效;罂粟果皮中所含的吗啡碱是著名镇痛剂；奎宁碱是有价值的解热药；三尖杉碱和长春花碱是治癌良药；秋水仙素（碱）能人工诱变产生多倍体。,托品类生物碱：颠茄产生的次级代谢产物，具有松弛平滑肌，阻断汗与唾液分泌的作用。,莨菪碱：古希腊神殿女祭司发布预言前，在仪式中燃烧莨菪，由于烟中含有令人失忆的东莨菪碱，因此被用来作为洗脑的药物。现今眼科或外科手术前使用的镇静药物，或晕车晕船时贴在耳后的贴剂，均含有东莨菪碱。具有与阿托品相类似的生理活性。,古柯碱：来自古柯树的叶子，是早期南美洲土人的零食。十九世纪时，欧洲探险家见到南美洲土人咀嚼一种灌木
8、树叶后，不需进食就可长期劳动，因此将树叶带回欧洲研究，最后分离得到能令人舌头麻木的古柯碱（cocaine）。美国早期生产的可乐亦含有古柯叶萃取物。后来据此开发出麻醉药品。,吗啡和可待因：吗啡对中枢神经有麻醉作用，有极快的镇痛效力，但易成瘾，不宜常用。可待因是吗啡的甲基醚。可待因与吗啡有相似的生理作用，可用以镇痛，但可待因主要用作镇咳剂。麻醉剂海洛因是吗啡的二乙酰基衍生物，即二乙酰基吗啡。海洛因镇痛作用较大。并产生欣快和幸福的虚假感觉，但毒性和成瘾性极大，过量能致死。,吗啡,可待因,海洛因,麻黄碱：是含于中药麻黄中的一种主要生物碱，又叫麻黄素，仲胺类生物碱，不具含氮杂环，因此它们的性质与一般生物
9、碱不尽相同，与一般的生物碱沉淀剂也不易发生沉淀。麻黄碱具有兴奋中枢神经、升高血压、扩大支气管、收缩鼻粘膜及止咳作用，也有散瞳作用，临床上常用盐酸麻黄碱（即盐酸麻黄素）治疗气喘等症。,小檗碱：小檗碱又名黄连素，存在于小檗属植物黄柏、黄连和三颗针中，它属于异喹啉衍生物类生物碱，是一种季铵化合物。黄连素具有较强的抗菌作用，在临床上常用盐酸黄连素治疗菌痢、胃肠炎等疾病。,长春新碱：又名醛基长春碱，存在于夹竹桃科植物长春花中，属于双聚吲哚类生物碱，长春新碱对白血病、癌症均有效，且毒性较低。,喜树碱：从喜树的种子或根皮中提炼出的一种生物碱，是DNA合成抑制剂，对DNA合成期的肿瘤细胞有较强的杀伤作用。主要
10、用于治疗消化道癌包括食管癌、贲门癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、其中对胃癌的疗效最好。对肺癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌、急性白血病、慢性粒细胞白血病也有一定疗效。,人类白血病T细胞经1微升喜树碱处理凋亡,HL-60 cells（急粒，p53缺陷）被喜树碱诱导3小时,（2）糖苷类：某些有机化合物和糖经苷键结合而成。很多糖苷类化合物对疾病有治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用，大黄中的蒽醌苷有强烈的泄下作用，紫草中的紫草宁可作为天然色素、抗菌药物和抗癌药物。,洋地黄（玄参科）,大黄（蓼科）,紫草（紫草科）,（3）挥发油：如薄荷油、丁香油、桉油等。,（4）有机酸：植物有机酸有苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等
11、。,（5）紫杉醇：紫杉醇属有丝分裂抑制剂或纺锤体毒素,和目前常用的化疗药作用机理 不同，它是诱导和促进微管的装配。紫杉醇具有聚合和稳定微管的作用，致使快速分裂的 肿瘤细胞在有丝分裂阶段被牢牢固定，使癌细胞复制受阻断而死亡。,2、生理活性物质（1）酶（2）维生素（3）植物激素（4）植物杀菌素,四、植物培养细胞的生理特性,1、植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积主要在稳定期完成。,2、很少以单一细胞悬浮生长，而多以非匀相集合体的细胞团形式存在。原因有二：（1）细胞分裂后没有进行细胞分离（2）间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其他形式形成粘性表
12、面，从而形成细胞团,3、纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，传统搅拌易损害植物的细胞壁。,4、植物细胞培养基粘度大，随培养时间延长，细胞数量增多，产生的粘多糖也随之增多，这些都易造成细胞培养液粘度增加。,5、植物细胞为好气性，培养过程中要不断供氧，但要保持较低的溶氧水平。,6、大多数植物细胞液体培养的pH值为5-7,应防止通气过高驱除CO2而使培养液的pH 升高。,7、光照可使植物细胞进行光合作用，解决部分碳源问题，但也防止光照不匀而使局部温度过高。,8、控制培养过程中的泡沫，维持培养过程的稳定性。,9、植物细胞培养过程中会造成在反应器内壁及附件上的沉积与粘附。
13、,第三节 植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备,1选取外植体：（1）带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。（2）根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体，然后形成再生植株。,外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化，顶芽比腋芽容易分化，萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养
14、中，最常用的外植体是茎尖，通常切块在05厘米左右，太小产生愈伤组织的能力差，太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为01毫米以下。,2外植体消毒：培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，既要全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前，常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精（70）等。,（1）茎尖、茎、叶片的消毒：消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除，茸毛较多的用皂液洗涤，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水纸吸干表面水分，用70酒精浸数秒钟，取出后及时用10次氯酸钙饱和上清液浸泡
15、1020分钟，或用210次氯酸钠溶液浸泡615分钟。消毒后用无菌水冲洗3次，用无菌纱布或无菌纸吸干接种。,（2）根、块茎、鳞茎的消毒：消毒前必须先用净水清洗干净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处，均用毛笔或软刷将污物清除干净，用吸水纸吸干后，在70酒精中浸一下，然后用0102氯化汞消毒510分钟，最后用无菌水清洗34次，用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。,（3）果实、种子的消毒：有的表皮上具有茸毛或蜡质，消毒前先用70酒精浸泡几秒钟或210分钟，然后用饱和漂白粉上清液消毒1030分钟或2次氯酸钠溶液浸1020分钟，消毒后去除果皮，取出内部组织或种子接种。,（4）花药、花粉的消毒：植物的花药外面常被花瓣、
16、花萼包裹着，一般处于无菌状态，只需采用表面消毒即可接种。通常先用70酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘，然后将花蕾剥出，在饱和漂白粉上清液中浸泡1015分钟，用无菌水冲洗23次，吸干后即可接种。,二、培养基及其组成,1.无机盐：氮（N）、硫（S）、磷（P）、钾、镁、钙等。,2、碳源：通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。,3、植物生长调节物：包括植物激素（植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量(1uM)有机物) 和植物生长调节剂（一些具有植物激素活性的人工合成的物质）。,植物生长调节物质,（1）生长素： 主要诱导刺激细胞分裂和根的分化，常用的生长素有：NAA（ -萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等。与IBA相比，NAA诱发根的能力较弱，诱发的根少而粗，但对某些植物如杨树等却具有很好的效果，IBA在根的诱导与生长上作用强烈，作用时间长，诱发的根多而长，特别有效，但也不可一概而论。对愈伤组织增殖最有效的是2，4-D，特别是对单子叶植物，10-7-10-5mol/L即可以诱导产生愈伤，常常不需再加细胞分裂素，但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。,
