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1、第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization,Content of Table,前 言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 生物芯片技术,前 言,核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。,Home,1 核酸分子杂交技术的原理,有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作
2、探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。 再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。,应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。,Home,2 核酸探针的制备,2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。,2.2 探针的制备方法,长度一般以50300bp为宜。制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成,2.3 探针的分类 据来源
3、及性质不同可分为： (1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针,2.4 合成寡核苷酸探针注意原则,(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。,Home,3 核酸探针的标记,为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。,3.1 标记的种类,同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
4、两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。,一个理想的标记物应满足： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。,3.2 探针的标记方法,3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法,Home,缺口平移法的原理,将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的53
5、外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列,随机引物标记法原理,用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的
6、单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。,末端标记法原理,（1）一种是在5末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的-磷酸转移加到DNA片段5-OH上。 （2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。,核酸修饰酶 3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、ddNR、NR的5-OH上加磷,用于探针的末端同位素标记,3 HO,5 HO,3 HO,5 HO,p 5,p 5,3 HO,3 HO,T4-PNP,pppATP,生物素光照标记法,光敏生物素在紫外线照射下与DNA或
7、RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。,4 核酸分子杂交技术,此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。,4.1 Southern 印迹杂交,带有DNA片段的凝胶,Southern 印迹杂交的技术流程,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,。,真空转膜,4.2 Northern印迹杂交,与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。,4.3 Western印迹杂交,将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上
8、的蛋白质。,4.4 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,Dot blotting and slot blotting,适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。,4.5 原位杂交 in situ hybridization,分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交,Home,5 生物芯片,生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。,5.1 生物芯片的分类,(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA mic
9、roarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip) (3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip),基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。,基因芯片,蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。,蛋白芯片,芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终目标。它将
10、样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，形成微型分析系统。目前，这种形式尚处于研发阶段。,芯片实验室,5.2 DNA芯片技术的基本原理,DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。,据芯片的性能与用途分： 1）毛细管型微芯片 2）基因探针型微芯片 据DNA芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片,5.3 DNA芯片的类别,芯片方阵的构建 样品制备 生物分子反应 信号的检测及分析,5.4 DNA芯片技术流程,可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。,5.5 DNA芯片应用,Home,
