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1、江苏版 生物,第41课时 基因工程概述,考点一 基因工程的工具酶与载体 1.限制性核酸内切酶“分子手术刀” (1)来源及化学本质:主要是从 中分离纯化出来的 。 (2)作用:催化作用,可重复利用;可用于DNA的切割获取 和 载体的切割。 (4)作用特点:特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割 。,原核生物,蛋白质,目的基因,特定位点,(5)切割方式:包括错位切和平切。错位切是指产生两个相同的 ;平切是形成 。 2.DNA连接酶“分子缝合针” (1)DNA连接酶的功能:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开 的两个核苷酸间的 。 (2)DNA连接酶的种类:Ecoli DNA连接
2、酶和T4 DNA连接酶。 3.目的基因进入受体细胞的 “分子搬运工” (1)概念:将外源基因导入 时所需要的运载工具。 (2)常用的载体:质粒、噬菌体的衍生物、 等。 (3)最常应用的载体: 。,黏性末端,平口末端,磷酸二酯键,载体,受体细胞,动植物病毒,质粒,质粒DNA分子上至少包括:复制原点且能保证在受体细胞中进行独立复制 的 ;独特的 ;目的基因(外源基因)插入位点。,复制区,标记基因,考点二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的获取 方法:从 中获取;通过 扩增;通过 直接人工合成。 2.制备重组DNA分子 (1)制备重组DNA分子是基因工程中最核心、最关键的一步,在体外进行。 (2
3、)基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止子以及 等。如图所示。,基因文库,PCR技术,化学方法,标记基因,a.启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端。是RNA聚合酶识 别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。 b.止子:是转录终止的一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。 c.记基因的作用:筛选、鉴别受体细胞是否含有目的基因。,(1)将目的基因导入植物细胞: 法、 法和 法。 (2)将目的基因导入动物细胞:采用最多,也是最为有效的方法是 法。 (3)将目的基因导入微生物细胞:一般选用Ca2+处理受体细胞使其成为 ,然后再将这些感受态细胞和重组的基因表达载体混合于 缓冲液中
4、,在温度适宜的条件下,感受态细胞吸收 ,完成转化 过程。,3.转化受体细胞,农杆菌转化,基因枪,花粉管通道,显微注射,感受态细胞,DNA分子,1.(2014江苏单科,23A)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6 个核苷酸序列。 ( ) 2.(2013江苏单科,6A)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序 列。 ( ),4.目的基因的检测和表达,3.(2013江苏单科,6B)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序 列。 ( ) 4.切割质粒的限制酶均只能特异性地识别36个核苷酸序列。 ( ) 5.采用DNA分子杂交技术可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达。 ( ) 6.一
5、种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。 ( ) 7.基因载体上有一个或多个限制酶的切割位点,供外源DNA插 入。 ( ) 8.以大肠杆菌为受体细胞时,先要用Ca2+处理细胞以使其处于感受态。 ( ) 9.利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞。 ( ),突破一 有关基因工程的工具 1.限制性核酸内切酶的作用分析 (1)限制酶的作用:限制酶具有专一性,表现在下列两个方面: 识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。识别序列的特点:呈现碱基互 补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如 图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如: 以中心线为
6、轴,两侧碱基互补对称; 以 为轴,两侧碱 基互补对称。,切割特定序列中的特定位点,使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键断开。产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端 和平口末端。 a.黏性末端:当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别 切开时,产生的是黏性末端。 如:EcoR识别GAATTC序列,将G与A两个核苷酸之间的磷酸二酯键切 开。如下图所示:,b.平口末端:当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的则是平口 末端。 如:Sma识别CCCGGG序列,将C与G两个核苷酸之间的磷酸二酯键切 开。如图所示:,名师点拨 限制酶的选择依据 (1)根据目的基因两端的
7、限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。这 样才能保证标记基因的完整性,有利于对目的基因的检测。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶 切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要 确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性 末端。 质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏 这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因;如果所选
8、酶的切点不是 一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切 割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。,辨析比较 工具酶与其他酶的辨析比较,2.载体的作用及特点 (1)质粒能自我复制,既可以在自身细胞、受体细胞内,也可以在体外。 (2)注意基因工程中的载体与细胞膜上载体的区别:基因工程中的载体是人 为地将基因运载到细胞中的工具,其成分不单一;细胞膜上的载体是细胞自 身控制物质出入细胞的工具,本质是蛋白质。 (3)作为载体必须具有一个至多个限制性核酸内切酶切点,而且每种酶的切 点最好只有一个。因为某种限制性核酸内切酶 只能识别单一切点,若载体 上有一个以上的酶切点,则切割重
9、组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含 复制起点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限 制性核酸内切酶的一个切点,则酶切后既能把环打开接纳外源 DNA 片段, 又不会丢失自己的片段。,名师点拨 载体上标记基因的标记原理 载体上标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体 细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受 体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素, 所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的 受体细胞,原理如下图所示:,3.关于质粒的两个问题 (1)质粒的本质和功能:本质是小型环状DNA分子,功
10、能是将目的基因导入 受体细胞。,(2)质粒应具备的条件:能在宿主细胞内稳定保存并大量复制(也可在体外 复制);有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因连接;有特殊的 遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。,考向一 以选择题的形式考查限制酶的作用和特点 1.(2015江苏南京期中,21,2分)对如图所示DNA片段的说法不正确的是 ( ) A.甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶催化产生的 B.甲、乙之间可形成重组DNA分子,但甲、丙之间不能 C.DNA连接酶催化磷酸基团和核糖之间形成化学键 D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子,切割产生乙的限制酶的识别序列为:CAAT
11、TGGTTAAC,切割产生丙的限 制酶的识别序列为:CTTAAGGAATTC,由此可见,甲、乙、丙的黏性末 端是由三种限制酶催化产生的,A正确;甲、乙的黏性末端相同,因此可在 DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它们 之间不能形成重组DNA分子,B正确;DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖 之间形成磷酸二酯键,C错误;切割甲的限制酶的识别序列为:GAATTC CTTAAG,而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为:GAATTGCT- TAAC,因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子, D正确。,答案 C 切割产生甲的限制酶的识别序列为:GAATTCC
12、TTAAG,考向二 以选择题的形式考查载体的知识 2.(2015江苏淮安期中,5,2分)下列有关基因表达载体的叙述,不正确的是 ( ) A.具有复制原点,使目的基因能在受体细胞内扩增 B.具有启动子,使DNA聚合酶识别并开始转录 C.具有标记基因,有利于鉴别受体细胞中是否导入目的基因 D.具有目的基因,以实现产生特定的基因产物 答案 B 基因表达载体具有复制原点、启动子、目的基因、终止子 和标记基因。复制原点使目的基因能在受体细胞内扩增。启动子是RNA 聚合酶的结合位点。标记基因可用于鉴别受体细胞中是否含有目的基 因。目的基因表达可合成特定的基因产物。,3.(2015江苏泰兴一中段考,15,2
13、分)下图为基因表达载体模式图,下列相关叙 述正确的是 ( ) A.甲表示启动子,位于基因的首端,它是DNA聚合酶识别、结合的位点 B.乙表示终止密码子,位于基因的尾端,作用是使转录过程停止 C.丙表示目的基因,其作用是获取人们需要的性状 D.复制原点的存在有利于目的基因在宿主细胞内扩增,答案 D 甲表示启动子,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别、结 合的部位,A错误;乙表示终止子,位于基因的尾端,作用是使转录过程停止,B 错误;丙表示标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否有目的基因,C错误。,突破二 基因工程的操作过程 1.几种目的基因的获取方法,知能拓展 如果目的基因的序列是已知的,可用化学
14、方法合成目的基因, 或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。如果目的基因的核苷酸序列 是未知的,可以从基因文库中获取。 2.形成重组DNA分子,(1)目的基因是指编码蛋白质的外源DNA分子,没有启动子,若只将目的基 因导入受体细胞中无法转录。 (2)目的基因的表达需要调控序列,因而用作载体的质粒插入目的基因时须 有启动子,插入后须有终止子。 (3)要确定目的基因是否导入受体细胞,需要有筛选标记标记基因。 易混辨析 载体与基因表达载体的区别:与载体相比较,基因表达载体 增加了启动子、目的基因和终止子三个基因片段,其功能各不相同。 启动子(DNA片段)起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)
15、终止密码 子(RNA)。 3.转化受体细胞 (1)目的:使目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达。,(2)导入方法,(3)受体细胞的种类 植物:可以是卵细胞(受精卵)、体细胞(可经组织培养成为完整个体)。 动物:受精卵(因为体细胞的全能性受到严格限制)。 (4)转化的实质:目的基因整合到受体细胞DNA中。 知能拓展 (1)转化受体细胞是唯一不涉及碱基互补配对的操作步骤。 (2)农杆菌转化法常用于双子叶植物和裸子植物。基因枪法常用于单子叶 植物。,(3)常用大肠杆菌、酵母菌等作为受体细胞。以大肠杆菌作为受体细胞时, 为了使大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态要用CaCl2处 理;要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素时则必须用真核生物酵母菌,主要 原因是需内质网、高尔基体的加工、分泌;一般不用支原体的原因是它营 寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它无细胞核,不能合成 蛋白质。 (4)微生物作受体细胞的原因:主要是个体微小,代谢旺盛,繁殖速度快,获得 目的基因产物多。,考向 以非选择题的形式考
