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1、第七章 发酵过程中工艺参数的 检测和控制,发酵的一般流程,发酵生产水平取决于,菌种生产性能,生产代谢环境条件,发酵工艺控制即为检测控制发酵生产过程环境条件以达到代谢产物高产量。,第一节 工业发酵的主要类型,一、按投料方式分 分批、连续培养、补料分批 二、按菌体生长与产物形成关系分 生长关联型、生长部分关联型、生长无关联型,（一）分批发酵法(batch fermentation) 分批发酵又称分批培养，发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。,优点：操作简单、染菌机会小，产品质量易于控制 缺点：前期营养多
2、抑止菌体生长、后期营养缺乏降低产物生成,（二） 连续发酵法(continuous fermentation) 在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中的菌体进行连续生长和发酵。,优点：操作条件稳定、易于自动化控制优化、设备利用率高、配件使用寿命长 缺点：发酵周期长、易于染菌、菌种易变异、设备要求高、菌体易挂壁和结团,（三） 补料分批发酵法(fed-batch fermentation) 补料分批发酵又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。,与分批发酵相比，解除营养无抑制、产物反馈抑制和葡
3、萄糖分解阻遏效应； 与连续发酵相比，它不会产物菌种老化和变异；,第二节 发酵过程的主要控制参数,一、物理参数 1 温度：与菌体生长，氧的溶解、产物合成都有关。 如四环素生产菌在30时合成金霉素，35时，只产生四环素，合成方向会改变。生长温度与合成温度不同。如青霉素，生长30，合成24.7。,2 压力（Pa，帕斯卡）。 罐内维持压力。维持正压避免污染；影响的氧的溶解度 98070Pa=1Kg/cm2 1Mpa 103Kpa =106Pa。 灭菌压力 1Kg/cm2=0.11Mpa。 发酵罐压一般为 0.020.05Mpa。,3搅拌转速（r/min）。 与氧的溶解相关。 罐体积 转速（r/min）
4、 通风量（m3/m3. min ） 50L 550 1：0.6 50000L 110 1：0.12 一般来说，假如小罐与大罐的几何相同。但为什么转速会相差这么大？原因大罐气液接触时间长，氧的溶解率高，搅拌和通气均可小些，,4搅拌功率（KW） P/V KW/m3 搅拌器搅拌时所消耗的功率。与氧的传递有关。 生产上：一般用瓦特计直接测量电动机的耗用功率，从中减去各项传动摩擦所损耗的功率。对小罐，误差较大。用电阻应变式动力计测量。,5 通气量（V/V.min） 指每分钟每单位体积发酵液通进的空气体积。 与溶氧相关。 气体流量用转子流量计测量。,6粘度 Pas(秒） Pa= 1N/m2 是细胞生长和细
5、胞形态的一项标志，它的大小可影响氧传递的阻力，又可表示相对菌体的浓度。 用黏度测定仪测定。,7料液流量（L/min) 控制进料的参数。 用流量计测定。,二、化学参数,1 PH：发酵过程中产酸或产碱的生化反应的综合结果。与菌体生长、产物合成有关。pH计测定。,2 基质浓度：指营养成分的浓度，发酵过程中必须定时测定还原糖，总糖，磷酸盐、氮（氨基酸或氨氮）等基质的浓度。 与菌体生长、产物合成有关。 在线或离线检测。,3 溶解氧浓度（DO）：mmol/L, mg/L, ppm或用% （指饱和浓度的百分数）表示。利用它的变化可了解生产菌对氧利用的规律也能反映发酵的异常情况。在线电极检测,4 产物的浓度：
6、 监测发酵是否正常。常离线检测。,6 废气中氧和二氧化碳的浓度： 监测生产菌的摄氧率、呼吸熵和发酵罐的供氧能力。 用顺磁氧分析仪测定氧气的浓度，用红外二氧化碳分析仪测定二氧化碳浓度。,5 氧化还原电位（ mv ) 影响微生物的生长。 在线检测电极,三、生物参数,1.菌体形态：观察菌体形态是生产 中最常用的方法。 用于衡量种子质量区分发酵阶段 控制发酵过程 决定发酵周期 能及时发现异常染菌 镜检,如青霉素生 产，生产菌生长分为I.孢子发芽，II.菌丝增殖，III.菌丝分枝旺盛，出现脂肪颗粒，IV.菌丝生长减缓，细胞内出现小气泡，V.气泡增大，颗粒消失，产物形成，VI.气泡延伸，菌丝自溶。,2.
7、菌体浓度：测定方法有三种： A.湿重法：量100ml发酵液，进行过滤，滤后菌体用水洗净，然后用吸水纸将水分挤干，直接称量。,B.干重法：上述步骤菌丝放85烘干至恒重。,C.体积法：取样品10ml放于刻度离心管内，用转速为3000转/分离10min，计算%（V/V）。固体原料也在其中，但如培养基组成不变条件下，具有相对准确性。,第三节 菌体浓度对发酵的影响及控制,菌体浓度 单位体积发酵液中菌体的含量。 影响 目的产物的产率 发酵液溶解氧 补料策略,（1）对产物产率的影响 对于生长关联型，菌体浓度越大，产物产率越大 对于生长部分关联型 ，菌体浓度越大，营养成分消耗越大，导致分批发酵过程中第二阶段由
8、于营养成分不足产物产率下降,（2）菌体浓度对发酵液溶解氧的影响 菌体浓度增大，溶解氧降低，影响菌体生长及产物合成 临界菌体浓度 P93 图73,首先确定基础培养基配方中有个适当的配比，避免产生过浓（或过稀）的菌体量。 然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过临界浓度，对产物合成产生抑制作用。,菌体浓度的控制：中间补料控制培养基浓度。,菌体浓度检测方法： 浊度法：分光光度计直接测定发酵液OD值 干重法、湿重法、体积法,基质浓度即培养微生物的营养物质，培养基中各成分浓度。 影响 菌体生长 产物合成 溶解氧,
9、第四节 基质浓度对发酵的影响及控制,1. 碳源对发酵的影响及控制,迅速利用的碳源 缓慢利用的碳源,葡萄糖、蔗糖等 迅速参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；,多数为聚合物，淀粉等 为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，也有许多微生物药物的发酵所采用。,在工业上，发酵培养基中常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源。,2. 氮源对发酵的影响及控制,迅速利用的氮源 缓慢利用的氮源,氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）、玉米浆 容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成特别是某些抗生素的合成
10、产生调节作用，影响产量。,延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量；但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，缩短产物的分泌期。,发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源，还要在发酵过程中补加氮源来控制浓度。,补加有机氮源，如酵母汁、玉米浆、尿素 补加无机氮源，如氨水或硫酸铵,3. 磷酸盐对发酵的影响及控制,磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。,微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L， 次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L.,磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。,（1）对菌体
11、的生长 基质浓度有一定的限值 P94 图74,（2）对产物合成的影响 高基质浓度对产物合成不利 （3）对溶解氧的影响 高浓度降低溶解氧的传递,基质浓度的控制方式：中间补料,补料的内容 补充能源和碳源 补充氮源 补充微量元素和无机盐 补充诱导酶的作用底物 补料的原则：根据微生物的生长代谢与生物合成规律，控制微生物的中间代谢，使之向有利于生产的方向发展。通常中间补料的数量为基础料的1-3倍。,补料的时间,补料的时间很重要，有人研究加糖时间对四环素发酵单位的影响。 接种 20h 45h 62h 产量 6000 u/ml 10000 u/ml 5000 u/ml 一般认为，过早补糖，可能刺激菌丝生成，
12、加速糖的利用，过迟补糖，可能菌丝的内在质量已受到一定损害，补糖只是干扰代谢并不能提高产量。,补料方式及控制,连续流加、不连续流加、多周期流加 快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加 单组分流加、多组分流加,补料方式,流加操作控制系统,直接以限制性营养物浓度作为反馈参数，如控制氮源、碳源、C/N比等，由于目前缺乏能直接测量重要参数的传感器，因此直接方法的使用受到了限制。,补料的实例: 如庆大霉素生产，大罐总体积20吨，第一次装料7吨，接种后15h一次性补5吨，然后在30-60h中小量间隙多次补入6吨料（全料），视生长情况决定是否在80h补适量水。总周期120-130h。,第五节 溶氧的浓度对
13、发酵的影响及控制,O2在水中的溶解度很低。如在25，1个大气压下O2溶解在水中的量为0.2mmol/L，或6.4mg/L。而微生物需氧量2050mmol/L.h，正常情况下，只能维持2050秒钟,水中氧消耗完。 不断向培养基中供应氧气，才能保证需氧微生物的正常代谢。,一、溶解氧对发酵的影响,1.对微生物生长的影响 对厌氧微生物是有毒性的； 对需要微生物： 微生物对氧的需求： 1、 C6H12O6+6O26CO2+6H2O+能量 从分子式看出，180g葡萄糖完全氧化需190克O2。 2、构成细胞成分含有氧，如酵母细胞元素组成为C3.95 N6.5 O1.94。,不同微生物的需氧量不同。 呼吸强度
14、（o2） mmol o2/g（干菌体）.h 单位重量的干菌体每小时消耗的氧量。 微生物摄氧率（ ）mmol O2/（L） 单位体积培养液每小时消耗的氧量。 两者关系 =Qo2.X X 发酵液中菌体密度（ g/L）。,微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个 最低要求，这个浓度叫临界氧浓度。,不同微生物C临界不同，见下表： 菌种 温度. C临界（mg/L） 大肠杆菌 37.8 0.26 酵母菌 34.8 0.15 产黄青霉 24 0.7 表明青霉菌摄氧率高，发酵时空气通气量大。,同一种菌生长不同阶段C临界不同。如幼龄菌大于老龄菌,2、溶解氧对产物合成的影响,微生物产物合成存在最低溶氧浓度为产物合成临界氧
15、浓度。 生长临界氧浓度往往与产物合成临界氧浓度不是同一值。,二、发酵液溶解氧浓度控制供、需平衡,供氧控制,氧在溶液中的传递,N= KLa （C*CL) 式中 N氧的传递速率， mmol O2 /h； C* 溶液中饱和溶氧浓度，mmol O2 L； CL溶液主流中的溶氧浓度， mmol O2 L； KL以浓度差为推动力的氧传质系数， mh； a比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积m2m3 ）。 因为a很难测定，所以将KLa当成一项，称为液相体积氧传递系数，1h,氧的传递方程式,影响C*-CL的因素： 1提高C*。 饱和浓度：气体与液体相接触，气体分子就会溶解于液体之中。经过一段时间的接触，气体分子在气液两相中的浓度就会达到动态平衡。 溶解氧的饱和浓度（ C* ）的单位可用mmol o2/L 、ppm、和mg o2/L。 影响氧饱和浓度的主要因素有：温度、氧分压、溶液的组成,不能随意改动,氧分压； 亨利公式：C*=H-1Po2 C*在平衡状态下液体中氧的溶解度（m mol o2/L） Po2氧分压 MPa H亨利常数MPaL/ mmol o2 从公式中可知C*与Po2成正比。气相中氧的浓度取决大气压和纯氧；罐压提高，Po2提高。C*增大，但不能太高，纯氧也可提高。利用吸氮装置，减少空气中的氮气，增加氧含量。
