《植物组织培养技术 教学课件 ppt 作者 王洪习 第四章：植物离体培养体系2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织培养技术 教学课件 ppt 作者 王洪习 第四章：植物离体培养体系2（89页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章：植物离体培养体系的建立,主讲教师： 王洪习 联系方式：,第二节： 无菌外植体的选择与处理,本节主要内容 外植体的种类与选择 外植体的消毒 外植体的接种 外植体的初代培养与观察 培养条件 外植体的污染及其防治 外植体的褐化及其防治 外植体的继代培养 培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不定芽的诱导与分化。 试管苗的增殖与生根诱导培养 试管苗的玻璃化与防治,学习目标,掌握外植体选择、消毒及接种的方法与技能 熟悉外植体初代培养与观察的方法与过程 理解外植体污染与褐化的原因，掌握防治外植体污染与褐化的方法与技能。 掌握培养物的分化诱导培养的方法与技能 掌握试管苗的增殖与生根诱导培养的方
2、法与技能 理解试管苗玻璃化的原因，掌握防治试管苗玻璃化的方法与技能。,一、外植体的种类与选择,1、外植体的种类 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对象。,常见外植体类型,茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限） 茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）； 花球和花蕾 种子、根、块根、块茎、花瓣等。,常用的培养部位,茎段,茎尖 叶片,2、外植体的选择,
3、选择原则 选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加实用性。 选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。 选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料。 选择适宜的大小：根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm之间。 考虑发生途径：,外植体的选择与发生途径密切相关,微型扦插法：带一叶的单芽茎段 丛生芽增殖法：茎尖或腋芽 器官发生法：根、茎、叶或花器官的各部分 胚状体发生法：胚性分生组织或生殖器官,二、外植体的消毒与接种,掌握一个原则：杜绝一切可能的污染 明确污染来源 作好接种准备 注意接
4、种操作 监测接种效果,人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。,物品因素,器皿和用具,培养皿：洗热压 玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦湿布擦 泡75%95%酒精烧,培养基：湿热,培养材料,外部细菌：用水冲洗化学药剂处理 内部细菌,茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平,操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛： 高锰酸钾=10:1),污染来源,（一）接种室的灭菌 （二）工作人员接种前应做的准备工作 （三）接种器皿、用具的灭菌 （四）超净工作台的灭菌 （五）材料的灭菌,作好接种前准备,接种室的灭菌,接种室的地面，墙壁要擦洗干净
5、接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2 接种室还可以采用紫外灯灭菌,超净工作台的灭菌,开风机前将紫外灯打开30分钟以上 之后开风机15分钟 操作前用70%75%酒精洗工作台面,工作人员接种前应做的准备工作,个人卫生，穿工作服 洗手 用70% 75%酒精擦手,酒精擦拭手,接种器皿、用具的灭菌,用具先用70%75%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧或用接种灭菌器灭菌。,酒精灯灼烧,器械消毒,酒精擦拭培养皿,外植体接种全过程,外植体消毒,浸泡5min,酒精擦拭,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,修剪外植体,外植体的灭菌处理,外植体灭菌流程 常用灭菌剂 灭菌关键性问题 适当的搭配 适当的浓度 适当的时间,外植
6、体灭菌流程,外植体的预处理,对外植体进行修整,去掉不要的部分,在流水下冲洗干净.,外植体的表面灭菌,原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样,常用灭菌药剂的使用和效果：,常用的灭菌方法,(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗-75%酒精浸泡10-20min-无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min-无菌水洗3-4次 （2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸10min-无菌水2-3次-取出种子培养 （3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗-纯酒精漂洗-升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15mi
7、n-无菌水洗3次 （4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟-无菌水洗2-3次-漂白粉上清液浸10min-无菌水洗2-3次,1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。 2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。 3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。,消毒注意事
8、项,灭菌关键性问题,适当的灭菌剂搭配 适当的灭菌剂浓度 适当的灭菌时间,注意接种操作,防止污染 分布均匀 注意根据培养对象选择接种方法,防止污染,防止空气污染 防止操作带来的污染 防止器皿用具污染,防止空气污染,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,错 误,防止操作带来的污染,A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,错 误,错 误,错 误,B、接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,防止操作带来的污染,正 确 错 误,D、瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,防止操作带
9、来的污染,正 确 错 误,防止器皿用具污染,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,分布均匀,外植体必须与培养基紧密接触，且在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一致,正 确 错 误,注意根据培养对象选择接种方法,根据培养对象采取相应合适的接种方法，具体为： （1）种子和分生组织 （2）接种茎段 （3）接种带腋芽的茎段,（1）种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,（2）接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,（3）接种带腋芽的茎段：为促进带顶芽的离体茎段中腋芽的生长，最好将
10、茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。,正 确 错 误,三、外植体的初代培养与观察,培养条件及其调控 细菌污染 真菌污染 材料内部带菌,细菌污染,表现： 发酵状 水渍状 滴形云雾状,污染原因： 培养基灭菌不过关 接种器具污染 操作污染 交叉污染,真菌污染,表现： 灰、白、黄、绿菌丝体、孢子组成绒毛状物有色圈,污染原因： 培养室湿度过大 瓶口积落有灰尘和孢子。,材料内部带菌,在培养基中表现的症状 外植体接触培养基部位长菌 外植体损伤部位长菌 外植体生长不良或表现出缺绿 诊断 培养基添加有机物检测,培养技术,初代培养技术 继代培养 生根培养 激素在培养过程中的应用,初代培养,初代培养目
11、的 初代培养成功的要素 初代培养外植体的褐变,初代培养目的,获得无菌初代培养物,无菌初代培养物,芽（单芽、丛芽） 愈伤组织 胚状体 原球茎,芽（单芽、丛芽）,愈伤组织,胚状体,初代培养成功的要素,1.无菌 2.条件合适: A 材料种类的选择及培养部位. B 合适的培养基,主要指激素及其他添加物 C 合适的培养条件 3.技术过关，管理得当,初代培养外植体的褐变,褐变现象 褐变原因 褐变影响因素 初代培养常见问题：褐变,褐变现象,有的植物材料在接种后材料的表面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象，褐色会严重影响外植体的生长分化，成为植物组织培养的一大障碍。,褐变原因,褐变是指外植体在培养过程中体内
12、的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象,褐变影响因素,基因型:植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变 。 材料的生理状态:一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 培养基的成分：培养基中6BA或KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 材料转移时间：,褐变的防止,三个选择 分生能力强的外植体 合适的无机盐成分浓度、合适的蔗糖浓度和 激素水平 适宜的温度 两个加入 活性碳 抗氧化剂 一个连
13、续 连续将材料进行转移,继代培养,继代培养的概念 继代培养的目的 继代培养的方法 提高增殖速度的方法 继代培养常见问题,继代培养的概念,将培养物转移到培养基成分不变的新鲜培养基上进行培养。,继代培养的目的,将初代培养物扩大繁殖。,继代培养的方法,不同初代培养产物继代方法： 无菌短枝：切割茎段 丛生芽：分离芽从 愈伤组织：分离愈伤组织 胚状体：分离胚状体 原球茎：分离原球茎,无菌短枝,切割,丛生芽,分离,愈伤组织,分离,提高增殖速度的方法,改进培养基 选择合适的激素种类及浓度配比 改善培养条件 温度 光照 湿度 PH,继代培养常见问题,变异问题 玻璃化问题,变异问题,变异现象 影响变异的因素：
14、基因型 发生途径 继代次数 减少变异的措施： 选择变异率低的品种 选择不容易产生变异的发生途径 严格控制继代代数（10代以内）,玻璃化问题,玻璃化现象 玻璃化现象产生的主要原因： 培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象,玻璃化现象的预防措施,适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他
15、物质,克服玻璃化现象的措施： 两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量； 两个“增强”：增强通风；增强光照； 两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA； 一个“减少”：减少培养基氮含量,生根培养,生根的方法 试管内生根 试管外生根 生根培养基的特点,生根的方法,试管内生根 生根过程在试管内完成 试管外生根 试管嫁接,试管内生根,影响试管内生根的因素,植物材料 培养基 植物激素 营养元素 其它物质（核黄素、活性碳） 培养条件 光照 pH 温度,移栽,试管苗的生长环境 试管苗的弱点 克服弱点，提高移栽成活率的措施,试管苗的生长环境,无菌 异养 高温 弱光 恒温,试管苗的特点（弱点）,形态解剖方面 （1）根 无根毛 根与菌的输导不相连。 （2）叶 叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。 无表皮毛，保水和反光能力差。 叶细胞结构疏松。 叶气孔突出，张大。 叶存在排水孔。 生理功能方面 根的生理功能：低 叶片表面极易散失水分 气孔不能关闭 叶光和能力较低，CO2固定能力差。,克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施 （1）移栽要抓三个关键 水分的平衡（不要失水过多） 温度和光照（不能太高） 光和能力逐步形成或加强 （2）提高移栽成活率的技术措施 移栽前的工作 移栽时应注意的
