分析化学第20高效液相色谱法

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1、第二十章 高效液相色谱法 HPLC,第一节 概述,high performance liquid chromatography,一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点,以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,（一）HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相；分析周期长； 柱效低（H，n）；无法在线检测，灵敏度差 2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动

2、相；分析时间大大缩短； 柱效高（H，n）；可以在线检测，灵敏度高,2019/7/11,表 20-1 HPLC法与经典LC法性能对比 经典LC HPLC 固定相 一般规格 特殊规格 固定相粒度(m) 75500 310 粒度分布(RSD) 2030 5 柱长（cm） 10100 325（分析型） 柱内径（cm） 25 0.30.46 柱入口压强(MPa) 0.0010.1 240 柱效（理论塔片数/m） 10100 31048104 样品用量(g) 110 10-610-4 分析所需时间(h) 120 0.050.5 装 置 非仪器化 仪器化,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均

3、可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、热稳定性差、离子型等样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不

4、同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,三、高效液相色谱仪流程图,续前,四、HPLC的特点和应用,“三高” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,第二节 基本理论和条件选择,一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择,基础,一、塔板理论,二、速率理论（与GC对比）,1.,2）涡流扩散项A及其影响,2.,讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）,next,图示,bac

5、k,续前,3）传质阻抗项及其影响,固定相传质阻抗CS：因固定液膜厚度df极小，固定相传质阻 抗CS可以忽略 流动相传质阻抗Cm： 静态流动相传质阻抗CSm：在固定相微孔内的滞留的流动相产生 的传质阻抗 传质阻抗项与流动相的粘度及柱温有关,图示,降低板高的途径有： （1）小粒度（dp小）、均匀的球形化学键合相 （A、C小），匀浆法装柱 （2）低粘度流动相（C小），如甲醇（乙醇与甲醇的理 化性质相似却无毒, 但25时粘度是甲醇的2倍） （3）流速不宜过快（1ml/min），（Cu小） （4）增加柱长L，可增加n，但同时也增加tR, 增加分析时间，一般不可取的。 （5）柱温适当，如室温25左右,第三

6、节 各类高效液相色谱法,HPLC法分类： 按固定相聚集状态：液-液色谱法（LLC） 液-固色谱法（LSC） 按分离机理：分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法（BPC） 亲和色谱法（AC） 胶束色谱法（MC） 手性色谱法（CC）,基本类型色谱法,一、液固吸附色谱法（LSC） liquid-solid adsorption chromatography 流动相为液体，固定相为固体吸附剂,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心

7、能力的差异,分离前提：K不等或k不等,2019/7/11,2. 影响容量因子k的因素,在色谱柱一定（S与Vm一定）及柱温一定时，k与溶质、溶剂的性质有关。在吸附色谱法中，硅胶是最常用的吸附剂，故以硅胶为例讨论 硅胶与溶质分子的亲合力顺序（容量因子序）： 饱和烃芳烃有机卤化物醚酯醛酮醇胺羧酸 与硅胶亲合力大的溶质，k大，tR（或tR）大，晚出柱 流动相的极性 常用流动相以烷烃为底剂，加入适当极性调整剂组成二元或多元溶剂系统 流动相系统极性越大，洗脱力越强，容量因子越小，tR越小。 调整溶剂的极性，可以控制组分的保留时间。,续前,（3）固定相硅胶的活性,5. 其他固定相：高分子多孔小球：YSG 原

8、理：吸附+分配 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,3. 适用：分离极性化合物,硅胶吸水量，LSCLLC 硅胶含水量较小，吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量17%，硅胶失活载体，吸附的水固定液， 分配色谱,4出柱顺序： 硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱,二、液液分配色谱法（LLC）,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 4. 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）

9、极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,三、化学键合相色谱法（BPC）,（一）化学键合相 （二）反相键合相色谱 （reversed bonded phase chromatography, RBPC） （三）正相键合相色谱 （normal bonded phase chromatography, NBPC） （四）离子对色谱 （五）离子抑制色谱（了解）,（一）化学键合相,定义：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面， 而构成化学键合相,1分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2特点： 1）不易流失 2）热稳定性好 3）化学性能好， pH介于28范围内溶液中不变质

10、4）载样量大 5）适于梯度洗脱 6）应用范围广（正相、反相、离子对色谱等）,（二）反相键合相色谱法,1、分离机理：疏溶剂理论为代表,溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。,2、影响因素 溶质分子中非极性部分的总表面积，k ，tR 键合相中烃基的总表面积 ，k ，tR 洗脱液表面张力（含水量） ，k ，tR ,3.反相色谱中影响溶质保留的因素： （1）反相键合的烃基链长；（2）有机溶剂的比例； （3）流动相的pH； （4）流动相的盐浓度。,续前,4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小

11、的组分后出柱 6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,（三）正相键合相色谱法,1、固定相：极性键合相 如氰基（CN）、氨基（NH2）键合硅胶。 （经典：水饱和的硅胶） 2、流动相：类似与以硅胶为固定相的吸附色谱法 非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂） 3、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力,续前,4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性

12、分析极性大物质、糖类等,（四）反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 模型,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 离子对试剂的种类：碳链长度增加，溶质的k增大； 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。 3）适用：较强的有机酸、碱,反相离子对色谱法模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相：弱极性,+,(,),+,B,),+,流动相：极性,通式,（五）反相

13、离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质或pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素： 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：弱酸、弱碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,第四节 固定相,一、固定相要求：颗粒细、均匀、球形、耐高压 1. 液-固色谱固定相 硅胶：薄壳型；无定形全多孔硅胶(YWG)； 球形全多孔硅胶（ Y

14、QG） 2. 化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体 表面，而构成化学键合相 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS或C18）是最常用 的非极性键合相。 中等极性键合相 极性键合相,正相色谱,反相色谱,吸附色谱,2019/7/11,第五节 流动相（溶剂系统）,对流动相的要求： 与固定相不发生化学反应。 pH介于28范围内。 对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内（可用范围）或25（最佳范围）， k小，tR小； k大，tR大，峰宽变大； 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。,（一）流动相

15、对分离的影响（分离方程式）,（二）流动相的极性和选择性 流动相的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 流动相的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同,吸附色谱：同经典LC，二元或三元的有机溶剂，粘度小 正相色谱：同吸附色谱法 反相色谱：水-有机溶剂，粘度小，无UV吸收 常用水-甲醇或水-乙腈,续前,（三）洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）类似GC的等温度洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。 对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求 2）梯度洗脱：类似GC的程序升温 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵） 。 适于分析极性差别较大的复杂组分,缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度 有时引起基线漂移、重复性较差,2019/7/11,峰的鉴别：1苯； 2氯苯； 3对二氯苯 41，2，3三氯苯； 51，3，5三氯