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1、第九章 核酸代谢,Metabolism of Nucleotides,第四节 DNA的生物合成,Biosynthesis of DNA,重点内容,DNA的半保留复制 DNA的合成过程 冈崎片段 相关概念,基本知识体系,基因：合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。一般是DNA序列或RNA（RNA病毒） 基因组：一种生物体中的整套遗传信息，一般为一个受精卵或一个体细胞的细胞核中所有DNA分子的总和 顺反子（cistron)与基因相通，通常一个顺反子即一个基因；定义为：编码单条多肽链的一个遗传功能单位，即转录单位。 原核生物多顺反子，一条mRNA链编码几种功能相关联的蛋白质；（相反真
2、核生物单顺反子）,内含子与外显子,外显子(exon)：编码序列 内合子(intron)：插入外显子之间非编码序列 5-端和3-端非翻译区(UTR),一、DNA的半保留复制,半保留复制提出的实验依据： Meselson和Stahl （1958） 15NH4Cl标记 Ecoli DNA同位素标记技术 （15N14N）DNA的密度梯度离心技术 Cairna(1963) 利用放射性自显影，观察到Ecoli 染色体DNA复制中间过程 细菌培养技术 DNA提取技术等,Chargaff（1950）提出DNA碱基组成的规律 Watson和Crick（ 1953）提出DNA双螺旋结构模型，并推测DNA的半保留复
3、制,半保留复制提出的理论依据,The Replication of DNA in Escherichia coli . Matthew Meselson & Franklin Stahl Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1958 , 44: 671-682,二、 DNA半保留复制的定义,定义： 指遗传物质传代过程中，以母链DNA为模板，按碱基互补配对原则指导DN A新链的合成，子链DNA碱基序列与亲代分子完全一样，但一条链来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链。,相对的遗传保守 绝对的遗传变异,DNA半保
4、留复制的特点,亲代DNA两条链均可为模板 方向：5到3的方向合成新链 复制过程是双向进行 速度：非常迅速 需DNA或RNA引物 合成过程是半不连续的 DNA由拓扑异构酶催化局部解旋 真核线性DNA末端（端粒）的复制需端粒酶参与,三、DNA的复制酶之一,聚合酶：以DNA为模板，催化新链3,5-磷酸二酯键的生成 （1）原核生物DNA聚合酶有三类：DNA聚合酶I、聚合酶II、聚合酶III（pol I、II、III ） 1955年，Kornberg 大肠肝菌 中发现 DNA polymerase I， 获诺贝尔奖。,DNA polymerase I,功能 5- 3聚合酶、 5- 3外切酶、3- 5外切
5、酶 DNA损伤的修复 DNA复制过程中RNA引物切除后，空隙的填充 结构 单链多肽、球蛋白 分子量103 103D a 含锌原子,DNA pol II 与聚合酶I 相似，确切作用不详 1970年，德国Rolf Knippers发现 DNA pol III 结构：10种不同亚基组成，呈不对称二聚体 分子量：900 103D a 功能：与DNA复制有关 DNA pol IV 和 pol V（ 1999) DNA修复有关,DNA polymerase 家族,聚合酶活性中心锌指模型,DNA Polymerase II 蓝色区域,DNA polymeraseIII 的亚基,DNA Polymerase
6、III -Subunit,DNA Polymerase III,DNA Polymerase III 异二聚体结构,三、DNA的复制酶之二 真核生物DNA聚合酶,三、DNA的复制酶之三引物酶,名称：引发酶（引物酶） 功能：负责合成约10个核苷酸的RNA引物。 底物：核苷三磷酸 结构：引发酶与DNA聚合酶 形成复合体。 能量：NTP,三、DNA的复制酶之四连接酶,名称：连接酶（DNA ligase）1967年发现 功能：将双链DNA的单链切口形成3 - 5磷酸二酯键 能量：消耗 细菌连接酶以NADH为供能者；高等动物和噬菌体以ATP为供能者,名称：topoisomerase 核酸拓扑原因：DNA
7、复制过程，由于超螺旋的存在，结构紧密；解链过程，产生过度拧紧、打结、缠绕、连环等 功能：松弛超螺旋、克服复制、合成过程中产生的扭曲张力 类似核酸内切酶和连接酶的联合作用 类型： 型拓扑异构酶：切割DNA双链中的一股，并适时连 接，不需ATP，不形成超螺旋，参与复制和转录 型拓扑异构酶（解旋酶）：切割DNA双链，并适时连接， 不需ATP时，松驰负超螺旋；需ATP时，引入负超,三、DNA的复制酶之五 拓扑异构酶,拓扑异构酶,拓扑原因,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,三、DNA的复制酶之六 解旋酶,名称：解螺旋酶（helicase） 功能：复制叉年解开小段双链DNA形成单链，利于DNA合成 能量
8、：需要消耗,三、DNA复制之七 单链结合蛋白,名称：单链DNA结合蛋白（single- strand DNA binding protein,SSB） 功能：与单链DNA结合，阻止已解链DNA重新形成双链，保护核酸不被降解 结构：四聚体蛋白,八、复制因子C（RFC） 一种装载因子，作为DNA聚合酶和之间的连系物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。 九、核酸酶H（RNaseH）和盖内切核酸酶（FEN1） 参与去除RNA引物的作用。 RNaseH降解RNA引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端，由FEN1完成去除最后一个核苷酸。,三、DNA复制之其他,四、DNA复制有关酶及蛋白因子,真核生物D
9、NA复制体系,相关概念,双向复制(bidirectional replication)：原核生物DNA复制是从一个起始点开始，同时向两个方向进行。 复制起点(origin)：含有100200个碱基对的一段DNA。 原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体DNA有多个复制起始点。新链增长的方向:53 复制子(replicon)：两个起始点之间的DNA片段。人的基因组可能有104105个复制子 复制叉( replication fork): 复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形结构,真核生物复制起点,五、DNA复制过程,三个阶段: 起始 (Initiatio
10、n ） 延伸（ Elongation ） 终止（ Termination ）,1 起始过程,DnaA蛋白辨认 并结合起始位点,防止螺旋回复,单链结合蛋白,解链酶、拓扑异构酶,引物合成,引物酶,DNA解链,起始点oriC的确定,复制体的形成,连接酶,Dna A 识别起始点,Dna B和Dna C （协助解开DNA双链）,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体和引物,复制体,2 延伸过程,过程描述：DNA聚合酶催化下，解开的DNA单链为模板，四种dNTP为原料，新进入的 dNTP 与引物 3OH形成磷酸二酯键，由5向3方向延长子链。 延伸过程：半不连续复制 原因： DNA两条链为
11、反向平行，分别称为前导链（DNA 链3 到5 ）和随从链 ，DNA聚合酶的合成方向5- 3 。 半不连接复制定义：随从链的延伸方向与复制叉方向相反，先合成小片段然后再在连接酶的作用下连成完整DNA大分子。,领头链 (leading strand),顺着解链方向生成的子链，复制连续进行，得到连续子链。,引物,随从链 (lagging strand) 复制方向与解链方向相反，须解开足够长度模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。,冈崎片段,冈崎片段（Okazakifragment）,1968年冈崎（日本 ）利用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的
12、片段称为冈崎片段。 原核生物的冈崎片段为10002000个核苷酸，相当于一个顺反子（cistron），即基因的大小；真核生物长度约100200个核苷酸，相当于一个核小体 DNA大小。,半不连续复制 （semidiscontinuous replicaton),3 终止过程,原核生物 环状DNA双向复制，复制片段在复制终止点汇合 冈崎片段由DNA聚合酶I切除引物，由DNA连接酶连接 真核生物 染色体DNA呈线性复制，多复制点，复制在末端停止。 冈崎片段RNA引物水解：由RNase H降解RNA引物，留下单个核糖由盖内切核酸酶除去 DNA大分子的形成：DNA连接酶将相邻DNA片段连接形成大分子DN
13、A链,DNA复制特点及其他,严格遵守碱基配对原则 复制具有高度保真性 DNA聚合酶对碱基具有选择性 DNA聚合酶对复制过程具有校读功能 细胞自我修复系统（碱基错配概率10-1010-8 ）,真核与原核DNA复制比较,真核DNA复制过程更加复杂 多复制起点、多蛋白因子（增殖细胞核抗原等） ORC序列辨认起始点：此序列含有11个核苷酸组成的保守序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T） RNA引物（约10个核苷酸）形成后，再形成1530个核苷酸的DNA起始片段,真核与原核DNA复制比较,存在端粒(telomere)结构 定义：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 结构：由末端单链DNA序列
14、和蛋白质构成；末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短 序列。 功能：维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性 端粒酶(telomerase)催化的延伸爬行过程 参与蛋白：端粒酶模板、端粒酶协同蛋白 端粒酶逆转录酶,端粒DNA结构及复制,端粒结构,端粒重复序列,3端,端粒复制过程,端粒酶及复制过程,功能：端粒酶含有与端粒DNA互补的序列，并具有逆转录酶的性质。端粒酶负责端粒DNA合成。,六、线粒体DNA复制-D环复制,线粒体DNA有两个复制起点。第二个复制起点开始复制时，第一个复制起点已复制至全环DNA的2/3 ，并将外环取代出来，复制过程不对称。电镜下观察此结构似D形，称D环复制。,七、逆
15、转录过程,定义：以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序，在逆转录酶的催化下合成DNA的过程。 合成序列称为cDNA（互补DNA）,发现历史：1970年，美国Temin与Baltimore 在鸡肉瘤和小鼠白血病病毒等RNA肿瘤病毒中发现逆转录酶，并发展了中心法则。于1975年获得诺贝尔奖。,逆转录酶,功能： 以RNA为模板或以DNA为模板的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H（RNaseH）活性：水解模板RNA DNA内切酶、拓扑异构酶、解链酶和tRNA结合的活性 需要引物： 细胞内合成时需宿主细胞多聚dT作为引物 体外合成可人工合成引物,逆转录研究的意义,逆转录酶和机制的发现，是分子生物学研究中的
16、重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,八、DNA的损伤与修复,1、DNA损伤定义： 某些理化因素作用下，DNA结构发生的任何形式改变都 注意区别：突变、进化、淘汰。 2、DNA损伤的类型 碱基对的更换、碱基的缺失、插入、DNA链的断裂、链内或链间的交联、倒位等。 3、造成损伤的因素 外因：紫外线、电离、碱基类似物、修饰剂化学诱变剂等 内因：自发脱碱基、自发脱氨基、复制错配等 。,（一）突变是生物进化与分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变形成DNA多样性 （三）突变是某些疾病的发病基础 （四）突变导致死亡,DNA损伤突变的意义,射线与各种辐射 化学因素,造成DNA损伤的因素,5-FU 6-MP
