《微生物制药工艺及反应器第二版课件 教学课件 ppt 作者 于文国 主编 乔德阳 主审第十三章 维生素C的生产》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物制药工艺及反应器第二版课件 教学课件 ppt 作者 于文国 主编 乔德阳 主审第十三章 维生素C的生产（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十三章 维生素C的生产,第一节 概述 第二节 合成原理 第三节 生产工艺过程,化学工业出版社,学习目标,了解维生素C的性质及生物合成工艺原理； 熟悉莱氏法生产维生素C的生产工艺； 掌握两步发酵法生产维生素C的生产工艺。,第一节 概述,应用:维生素C（Vitamin C，VC）又名抗坏血酸，化学名称为L-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-内酯。是人体不可缺少的要素，维生素C是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。其结构式为：,性质：维生素C是一种白色或略带淡黄色的结晶或粉末，无臭、味酸、遇光色渐变深，水溶液显酸性。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿和石油
2、醚等有机溶剂。水溶液在pH为56之间稳定，若pH值过高或过低，并在空气，光线和温度的影响下，可促使内酯环水解，并可进一步发生脱羧反应而成糠醛，聚合易变色。,第二节 合成原理,莱氏法 德国的莱奇登（Reichstein）等人以D-山梨醇为原料，经黑醋菌（Acetobacter Melanogenum）一步发酵得L-山梨糖，将此糖在酸性条件下，经丙酮酮醇缩合，得双丙酮糖，再经次氯酸钠（或高锰酸钾）氧化得双丙酮-2-酮-L-古龙酸，再将后者水解去丙酮后经盐酸转化得维生素C。 这种方法用强氧化剂将L-山梨糖在4位的仲醇基氧化生成维C的重要前体2-酮基-L古龙酸（2-Keto-L-gulonic aci
3、d，简称2-KGA）。为了保护山梨糖C6位伯醇基不被氧化，就须在酸性条件下先用丙酮处理L-山梨糖，形成双丙酮衍生物后再进行氧化；氧化后还必须水解生成2-酮基-L-古龙酸 （不稳定，难分离出），再经转化而得维C。,两步发酵法 以氧化葡萄糖酸杆(Glnanobacter oxydans)为主要产酸菌，以条纹假单孢杆菌（Pseudomonas striata）为伴生菌的自然组合菌株，将L-山梨糖继续氧化成维C的前体2-酮基-L-古龙酸，最后经化学转化制备成维C。,第三节 生产工艺过程,莱氏法维生素C生产工艺过程,1D-山梨醇的制备 山梨醇是葡萄糖在氢作还原剂，镍作催化剂的条件下，将葡萄糖醛基还原成醇
4、羟基而制得的。,工艺过程 将水加热至7075，在不断搅拌下逐渐加入葡萄糖至全溶，制成50%葡萄糖水溶液，再加入活性炭于75，搅拌10min，滤去炭渣，然后用石灰乳液调节滤液pH8.4，备用。当氢化釜内氢气纯度99.3%，压强0.04Mpa时可加入葡萄糖滤液，同时在触媒槽中添加活性镍，利用糖液冲入釜内，以碱液调节pH为8.28.4，然后通蒸汽并搅拌。当温度达到120135时关蒸汽，并控制釜温在150155，压强在3.84.0MPa。取样化验合格后，在0.20.3MPa压强下压料至沉淀缸静置沉淀，过滤除去催化剂，滤液经离子交换树脂交换，活性炭处理，即得D-山梨醇。,2L-山梨糖的制备 经过黑醋菌的
5、生物氧化，可选择性地使D-山梨醇的2位羟基氧化成酮基，即得L-山梨糖。,工艺过程： 菌种部分 将黑醋菌保存于斜面培养基中，每月传代一次，保存于05冰箱内。以后菌种从斜面培养基移入三角瓶种液培养基中，在3033振荡培养48h，合并入血清瓶内，糖量在100mg/ml以上，镜检菌体正常，无杂菌，可接入生产。,发酵部分 种子培养分为一、二级种子罐培养，都以质量浓度为16%20%的D-山梨醇投料，并以玉米浆、酵母膏、泡敌、碳酸钙、复合维生素B、磷酸盐、硫酸盐等为培养基。 30340C ，通入无菌空气（1VVM），并维持罐压0.030.05MPa进行一、二级种子培养。当一级种子罐产糖量大于50mg/ml（
6、发酵率达40%以上），二级种子罐产糖量大于70mg/ml（发酵率在50%以上），菌体正常，即可移种。,发酵罐部分是以20%左右D-山梨醇为投料浓度，另以玉米浆、尿素为培养基，在pH5.45.6，灭菌消毒冷却后，按接种量为10%接入二级种子培养液。在3134，通入无菌空气（0.7VVM），维持罐压0.030.05Mpa等条件下进行培养。当发酵率在95%以上，温度略高（3133）、pH在7.2左右，糖量不再上升时即为发酵的终点。 后处理部分 将发酵液过滤除去菌体，然后控制真空度在0.05MPa以上，温度在60以下，将滤液减压浓缩结晶即得L-山梨糖。,32,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖（双丙酮糖
7、）的制备 山梨糖（酮式）经过互变异构转变成环式山梨糖，再与两分子丙酮反应，将其结构中2,3-位羟基及4,6-位羟基保护起来，生成2,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖。,工艺过程 生产中的配料比为L-山梨糖：丙酮：发烟硫酸：氢氧化钠：苯=1:9:0.4:0.6:6（摩尔比）。将丙酮、发烟硫酸在5以下压至溶糖罐内，加入山梨糖，在1520下溶糖6h后再降温至-8，保持67h得酮化液。然后在温度不超过25时酮化液中加入18%22%氢氧化钠溶液中，调节pH至8.08.5。下层硫酸钠用丙酮洗涤，回收单丙酮糖；上层清液蒸馏至100后，减压蒸馏至约90为终点，再用苯提取蒸馏后的剩余溶液，然后减压蒸馏苯液得丙酮
8、糖。,42,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸（双丙酮古龙酸）的制备 用次氯酸钠将2,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖氧化成2,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基古龙酸钠，再用浓盐酸酸化即得2,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸。,工艺过程 次氯酸钠的制造 次氯酸钠性质不稳定，久置易分解失去氧化性，所以需新鲜配制。在35下将14.5%15.5%氢氧化溶液搅拌通入液氯，以有效氯浓度9.5%9.7%，余碱浓度2.83.2%为终点。 双丙酮糖的氧化 配料比为双丙酮糖：次氯酸钠：硫酸镍=1：10：0.04(摩尔比)。将次氯酸钠、双丙酮糖及硫酸镍在温度40保温搅拌30min，然后静止片刻
9、，抽滤。滤液冷至05时，用盐酸中和，分三段进行：pH7，pH3，pH1.5。甩滤，冷水洗，再甩滤1h，即得2，3，4，6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸结晶。,5粗品Vc的制备 先将双丙酮古龙酸水解脱去保护基丙酮，再进行内酯化，最后进行烯醇化即得粗Vc。,工艺过程 配料比为双丙酮古龙酸（折纯）：精制盐酸（38%）：乙醇=1：0.27：0.31。 生产中先将部分双丙酮古龙酸加入转化罐，搅拌加入盐酸，再加入余下的双丙酮古龙酸，盖好罐盖。等反应罐夹层满水后，打开蒸汽阀门，缓慢升温至37左右关蒸汽，自然升温至5254，保温57h。反应到达高潮时，结晶析出，要严格控制温度低于60，高潮期过后，维持505
10、2至总保温时间20h。接着开冷却水降温1h，加入适当体积的乙醇，冷却至-2，放料，甩滤0.5h，再用乙醇洗涤，甩滤33.5h，经干燥得粗Vc。,6粗品Vc的精制 配料比为粗Vc（析纯）：蒸馏水：活性炭：乙醇=1：1.1：0.06：0.6（质量比）。将粗品Vc真空干燥（0.9MPa，45，2030min），除去挥发性杂质（盐酸、丙酮），加蒸馏水搅拌，待Vc溶解后，加入活性炭，搅拌510min，压滤，滤液至结晶罐，加入50L乙醇，降温后加晶种使结晶。将晶体离心甩滤，再加乙醇洗涤，甩滤，将甩干品真空干燥（0.9MPa，4345，1.5h）即得精制Vc。,两步发酵法维生素C生产工艺,1D-山梨醇的制备
11、（见莱氏法） 2L-山梨糖的制备 （1）菌种部分 黑醋菌部分同莱氏法 （2）发酵液制备部分 基本同莱氏法，只是D-山梨醇的投料浓度适当低些，10%左右。 （3）发酵液处理部分 发酵终点后对生成的L-山梨糖（醪液）应立即于80加热10min，杀死第一步发酵液微生物后，冷却至30，再开始进行第二步的混合菌株发酵。,32-酮基-L-古龙酸的制备,（1）菌种部分 将保存于冷冻管的假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌菌种活化，分离及混合培养后移入三角瓶种液培养基中，在2933振荡培养24h，产酸量在69mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常无杂菌，再移入血清瓶中，即可接入生产。 （2）发酵液制备部分 先在一级种
12、子培养罐内加入经过灭菌后的辅料（玉米浆、尿素及无机盐）和醪液（折纯含山梨糖1%），控制温度为2930，发酵初期温度较低，通入无菌空气维持罐压为0.05MPa，pH6.77.0，至产酸量达合格浓度，且不再增加时，接入二级种子罐培养，条件控制同前。作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产生2-酮基-L-古龙酸，直到完全形成芽孢和出现游离芽孢时，产酸量达高峰（5mg/ml以上）为二级种子培养终点。,供发酵罐用的培养基经灭菌冷却后，加入至山梨糖的发酵液内，接入第二步发酵菌种的二级种子培养液，在温度30，通入无菌空气下进行发酵，为保证产酸正常进行，往往定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使保持7
13、.0左右。当温度略高（3133），pH 在7.2左右、二次检测酸量不再增加，残糖量0.5mg/ml以下，即为发酵终点，得含古龙酸钠的发酵液。 整个发酵过程可分为产酸前期、产酸中期和产酸后期。影响发酵产率的因素主要有山梨糖初始浓度、溶氧浓度、 pH值等。,（3）2-酮基-L-古龙酸的分离 发酵液中除了含有一定量的2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸外，还含有大量的菌体蛋白。要将2-酮基-L-古龙酸钠从发酵液中分离提取出来，必须先除去菌体蛋白。除去菌体蛋白的发酵液中含2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸，由于2-酮基-L-古龙酸钠（能解离为阴、阳离子），用732阳离子交换树脂进行交
14、换可去掉其中Na+而得2-酮基-L-古龙酸稀液。高温下2-酮基-L-古龙酸不稳定，所以为了浓缩古龙酸溶液使其达到一定浓度，可采用减压浓缩的方法。由于低温下2-酮基-L-古龙酸溶解度较小，所以可经冷却结晶得2-酮基-L-古龙酸晶体，从而实现了从发酵液中提取分离2-酮基-L-古龙酸的操作过程。,2-酮基-L-古龙酸的分离工艺及操作,（1）离子交换 将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以(23)m3/h的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。或将发酵液加入至循环槽，经冷却调节pH值后，用泵打入微滤膜、超滤膜过滤器内除去菌体及蛋白类物质后
15、，将滤液压入阳离子交换柱内进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出液达到一定pH值时，则更换树脂进行交换，原树脂进行再生处理。, 将经过一次交换后的流出液和洗液合并，在加热罐内调pH至蛋白质等电点，然后加热至70左右，加0.3%左右的活性炭，升温至9095后再保温(1015)min，使菌体蛋白凝结。停搅拌，快速冷却，高速离心过滤得清液。 将酸性上清液打入二次交换柱进行离子交换，至流出液的pH1.5时，开始收集交换液，控制流出液pH1.51.7，交换完毕，洗柱至流出液古龙酸
16、含量在1mg/ml以下为止。若pH1.7时，需更换交换柱。 （2）减压浓缩结晶 先将二次交换液进行一级真空浓缩，温度45，至浓缩液的相对密度达1.2左右，即可出料。接着，又在同样条件下进行二级浓缩，然后加入少量乙醇，冷却结晶，甩滤并用冰乙醇洗涤，得2-酮基-L-古龙酸。 如果以后工序使用碱转化，则需将2-酮基-L-古龙酸进行真空干燥，以除去部分水分。,4粗品维生素C的分离 分离得到的2-酮基-L-古龙酸，采取适当的方法可转化（酸转化和碱转化）为维生素C，将维生素C的溶液进行减压蒸发浓缩，然后冷却进行结晶，离心分离，得粗品维生素C。,酸转化工艺及操作 按配料比为2-酮基-L-古龙酸：38%盐酸：丙酮=1：0.4（W/ W）：0.3（W/ W）进行工艺配置。先将丙酮及一半古龙酸加入转化罐搅拌，再加入盐酸和余下的古龙酸。待罐夹层满水后开蒸汽阀，缓慢升
