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1、第五章 黄酮类化合物,要求,掌握黄酮类化合物的基本结构分类、重要的理化性质及显色反应;梯度pH萃取法分离黄酮类化合物、各结构类型的紫外图谱特征; 熟悉黄酮类化合物一般的理化性及显色反应、常用的提取方法、聚酰胺柱色谱分离特征,及其在分离黄酮类化合物中的应用、加入诊断试剂后引起的紫外吸收波长的位移及在结构测定中的意义 ; 了解黄酮类化合物生物合成途径及生物活性及NMR、MS 特征。,2苯基色原酮,第一节 概述 名称来源:分子中有羰基,且多显黄色 生源途径:复合途径 1、AAMA途径 2、桂皮酸途径 结构与分类:1、苷元 2、苷 糖的种类 葡萄糖、半乳糖、木糖等 糖的数量 单糖、双糖、三糖 糖的连接
2、位置 苷原子,苷元 黄酮、黄酮醇 二氢黄酮、二氢黄酮醇 异黄酮、二氢异黄酮 查耳酮、二氢查耳酮 花色素、橙酮 黄烷3醇、黄烷3、4醇 双苯吡酮类、高异黄酮类,黄酮类化合物的生物活性,1 对心血管系统作用 2 抗肝脏毒作用 3 抗炎作用 4 雌性激素样作用 5 抗菌抗病毒作用 6 泻下作用 7 解痉作用,第二节 理化性质及显色反应,一、性状 1、形态 2、旋光性 3、颜色 二、溶解性 1、苷元 共性、 水溶度的差异 2、苷 共性、 水溶度的差异,三、酸碱性 酸性 :7、4OH 最强;5OH 最弱 以黄酮为例 酸性强弱顺序: 7、4OH 7或 4OH 一般酚OH 5OH 碱性: 因黄酮的1位O原子
3、含未共用电子对,显弱碱性,可溶于浓酸成盐,显色反应,(一)还原反应 1、HClMg 反应 黄酮(醇)、二氢黄酮(醇) 2、NaBH4反应二氢黄酮(醇) 3、磷钼酸二氢黄酮,(二)与金属盐的反应 1、ALCl3反应 三种结构 2、Mg(Ac)2 反应 3、FeCl3反应 酚羟基 4、Pb盐 中性 沉淀邻二酚OH 碱性 除三种结构外、一般酚羟基 5、ZrOCl2枸缘酸反应 区别5OH;3OH 6、SrCl2反应鉴别邻二酚羟基,(三)硼酸反应 5-羟基黄酮2-羟基查耳酮 (四)碱性试剂反应 二氢黄酮显黄色 一般黄酮醇黄色加深; 邻二酚羟基黄酮,第三节 黄酮化合物的提取分离,一、提取 1、黄酮苷类与极
4、性较大的苷元(羟基黄酮,双黄酮,橙酮,查耳酮等)丙酮,乙酸乙酯,乙醇,甲醇,甲醇-水(1:1)等提取 2、多糖苷类: 沸水提取 3、花色苷类: 0.1% 盐酸提取 4、黄酮苷元: 氯仿,乙醚,乙酸乙酯等提取,(一)溶剂萃取法 1、原理:黄酮类化合物与混入杂质极性不同 2、举例: 石油醚 除叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素; 乙醇 除蛋白质、多糖类等水溶性杂质。 (二)碱提取酸沉淀法 1、原理:黄酮类化合物易溶于碱性水。 2、常用碱液:碳酸钠, 氢氧化钠, 氢氧化钙等,例如:从槐花米提取芦丁过程 槐花米加6倍量水煮沸以石灰乳调 pH=8-9微沸30min趁热过滤残渣再 水煮一次合并两次滤液 60-7
5、0时以 浓盐酸调节pH=4-5静置24小时抽滤 水洗至中性 60干燥得粗品芦丁 沸水重结晶 70-80干燥得纯品芦丁。,三)碳粉吸附法 1、适用范围:主要用于苷类的精制。 2、使用过程: 植物甲醇粗提物,加入活性炭,检查上清; 沸水、沸甲醇、7%酚/水、15%酚/醇洗脱; 减压浓缩7%酚/水洗脱液至小体积; 乙醚除去残留的酚 水层中含有较纯的黄酮苷类。 (四)聚酰胺吸附法 1、 聚酰胺对于黄酮类化合物是比较理想的吸附剂 2、洗脱剂:不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水 3、分离效果:粗分 例如:银杏叶黄酮的提取,(五)超临界流体萃取法 1、以CO2为单一流体萃取极性较低的游离黄酮或黄酮的碳苷类; 2、
6、在CO2中加入水、乙醇等作为夹带剂,萃取极性较高的黄酮或黄酮苷类。 例如:从甘草中提取黄酮类化合物,以CO2为单一流体可萃取极性较低的甘草查耳酮A、B; 在CO2-水-乙醇溶剂体系中则可提取极性较高的甘草素与异甘草素。,二、分离 (一)柱色谱法 1. 硅胶柱色谱: 主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化(或乙酰化)的黄酮及黄酮醇类。 在加水去活化后可用于分离极性较大的化合物,如多羟基黄酮醇及其苷类等。 硅胶中混存少量金属离子,应预先用浓盐酸处理除去,以免干扰分离效果。 分离黄酮苷元时,用氯仿-甲醇混合溶剂做移动相; 分离黄酮苷时,用氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水做移动相。,聚
7、酰胺的吸附规律 1形成氢键的数目越多,吸附越强 2形成分子内氢键的,吸附减弱 3分子内芳香化程度高者,吸附增强 溶剂对吸附能力的影响: 在水中易形成氢键,吸附强 在醇及有机溶剂中不缔合,吸附弱 洗脱剂洗脱能力: 水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,黄酮类化合物在聚酰胺柱上的洗脱规律,1、苷元相同,叁糖苷,双糖苷,单糖苷,苷元(先后顺序) 2、母核上羟基增加,洗脱慢; 羟基数量相同时,邻位的羟基洗脱快(分子内氢键) 3、不同的类型:异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇 4、共轭双键多吸附强:二氢黄酮查耳酮,3、葡聚糖凝胶柱色谱,原理:吸附(酚羟基)、分子筛 1、苷类先洗脱出(分子筛)按分
8、子量大小 2、苷元 酚羟基数量少先洗出 洗脱剂: 1、含盐水溶液,碱性水溶液 2、醇及含水醇 3、其它溶剂:氯仿-甲醇,丙酮-水,梯度pH萃取法适于酸性不同的化合物,黄酮类化合物酸性强弱 7,4-OH7-或4-OH一般酚羟基- 5%NaHCO3 5%NaCO3 0.2%NaOH 4%NaOH 举例:,根据分子中某些特定官能团进行分离,1、Pb 盐 法:具有邻二酚羟基、羧基醋酸铅沉淀 其它含酚羟基碱式醋酸铅沉淀 沉淀脱铅:1、H2S 2、硫酸盐、磷酸盐 2、硼酸络合法 具有邻二羟基,生成物易溶于水,第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定,色谱法 1、PC法 黄酮苷类 双向色谱法 1、醇性溶剂 分配
9、原理 2、水或水溶液 吸附原理 苷元类:醇性溶剂 检识:UV,氨水,三氯化铝,Rf值 醇性溶剂中:极性大, Rf值小(分配) 苷元(0.7)苷(0.5)苷元 非平面分子(二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮)0.10.3平面分子(黄酮等),UV及可见光谱在黄酮鉴定中的应用 黄酮化合物在MeOH中的UV 一般紫外特征 带:max 300400 nm(桂皮酰基) 带:max 220280nm (苯甲酰基),各类黄酮母核MeOH中的UV,黄酮294nm ;250nm 黄酮醇344nm;239nm 异黄酮305(sh);245nm 二氢黄酮310(sh);270nm 查耳酮312(a b); 230nm(
10、m) 橙酮370 nm;251nm,三大类的区别,1、有交叉共轭两个强,且 (黄酮醇 黄酮 ) 2、无交叉共轭强;(sh) ( 二氢黄酮 异黄酮 ) 3、无 吡喃酮带强;带(m) (查耳酮, 橙酮),加入诊断剂后引起的位移及其在结构测定中的意义,加入MeONa 鉴别 7OH;4OH ;3OH 加入NaOAc 鉴别7OH;4OH 加入NaOAc / H3BO3 鉴别 邻二酚OH 加入AlCl3/ HCL及ALCl3 加入AlCl3鉴别 3OH;5OH,实例解析 从中药柴胡中分离得到一黄酮成分 (山萘酚 3、5、7、4四羟基黄酮),UV数据如下:UV max(nm) MeOH:266(S);367
11、 (S) NaOMe:276;424 AlCl3 :270;424 AlCl3 / HCl:276;424 NaOAc:276;387 NaOAc / H3BO3 :276;387,NMR在黄酮结构分析中的应用,黄酮类各类质子的化学位移 总的范围和顺序: 09 ppm B环 A、C 环糖C1H 7.5 6.5 54.5,A环质子,7OH 黄酮 C5H C8H C6H ( 8.0, d, J=9Hz )( 7.0, d, J=2.5Hz)(6.9 ,dd) ? J= 5、7二OH黄酮 苷元: C8H C6 H 5.76.9 (d, J=2.5Hz),B环质子,C 4 氧取代 H-2,6 H-3,
12、5 7.1-7.9 6.5 7.1 (d, J=8,5Hz) C3 C 4 二氧取代黄酮 H-5 6.7 7.1 (d, J=8.5Hz) H-2,6 7.2 7.9 C3 C 4 C 5三氧取代 H-2,6 6.5 7.5,C环质子,黄酮C3H 6.5(S) 异黄酮C2H 7.67.8(S) 橙酮苄基H 6.56.7(S) 查耳酮H 7.37.7 H 6.77.4 二氢黄酮醇C2H 4.9 C3H 4.3 二氢黄酮C2H5.2 C3 2H 2.8,13CNMR谱在黄酮类化合物结构鉴定中的应用,1 化合物骨架类型的判断 中央三碳化学位移 2 取代图式的确定 X Zi Zo Z m Zp OH
13、26.6 -12.8 1.6 -7.1 OCH3 31.4 -14.4 1.0 -7.8,3 O-糖苷糖的连接位置 a 糖的端基碳 +4.4 +6.0 100 102.5 b 苷元的苷化位移 Zi 向高场位移 -1-3 Zo, Zp 向低场位移,MS在黄酮结构测定中的应用,黄酮苷元的MS特点(EIMS) 多数M强,且为基峰。 苷元裂解规律强,(RDA裂解;C环均裂),芸香苷的提取、分离和鉴定,1.芸香苷的提取水提取法 称取槐花米粗粉20 g(压碎),加沸水300 ml,加热煮沸30 min,纱布趁热过滤,残渣同法再操作一次,合并两次滤液,室温放置析晶,待全部析出后,减压抽滤,用蒸馏水洗涤芸香苷
14、结晶,抽干,得粗制芸香苷,置空气中干燥后,称重。 2.芸香苷的精制 取粗制芸香苷2 g,加蒸馏水400 ml,煮沸至芸香苷全部溶解,趁热抽滤,冷却后即可析出晶体,抽滤,得芸香苷精制品,置空气中干燥后,称重。,3.芸香苷的水解 取精制芸香苷1g,研细后置于250ml圆底烧瓶中,加入2%硫酸100ml,加热回流30min,瓶中混浊液逐渐变为澄清的棕黄色液体,最后生成鲜黄色沉淀。放冷沉淀,抽滤,保存滤液(应为澄清无色液体),用做糖的检查,沉淀物为芸香苷苷元(槲皮素),用蒸馏水洗至中性,抽干水分,晾干,称重。粗制槲皮素再用50%乙醇重结晶得精制的含2分子结晶水的槲皮素。 取芸香苷水解后的滤液10 ml
15、,加饱和氢氧化钡溶液(或碳酸钙粉末)中和至中性,滤去白色的硫酸钡沉淀,滤液水浴60浓缩至23 ml,加23 ml乙醇溶解,作为糖的供试液。,鉴定 1.呈色反应 取芸香苷及槲皮素精品约10 mg,各用5 ml乙醇溶解,制成样品溶液,按下列方法进行试验,比较苷元和苷的反应情况。 a. Molish反应 取样品溶液l ml,加10-萘酚溶液0.5 ml,振摇后斜置试管,沿管壁滴加0.5 ml硫酸,静置,观察并记录液面交界处颜色变化。 b. 盐酸镁粉反应 芸香苷与槲皮素溶液分别置于两试管中,加入金属镁粉少许,盐酸2滴3滴,观察并记录颜色变化。 c. 醋酸镁纸片反应 取两张滤纸条,分别滴两滴芸香苷、槲皮素的乙醇溶液,然后各加1醋酸镁甲醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。 d. 三氯化铝纸片反应 在两张滤纸条上分别滴加芸香苷、槲皮素醇溶液后,各加1%三氯化铝乙醇溶液两滴,观察颜色变化,记录现象。 e. 锆柠檬酸反应 取样品溶液2 ml,加入