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1、项目名称：肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制首席科学家：陈志南 中国人民解放军第四军医大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：陕西省科技厅 总后勤部卫生部一、研究内容本项目的关键科学问题是肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制。围绕细胞不典型增生原位癌原发癌转移癌的发生发展过程，筛选并确定肿瘤侵袭转移中参与肿瘤细胞恶性行为调控的关键分子/标志物，重点研究恶性肿瘤侵袭转移的分子调控机制，开拓肿瘤早期预测、诊断和调控阻抑治疗的新方法、新领域。肿瘤发生和转移分子调控机制粘附因子分子基础血管生成信号转导基质降解免疫细胞/肿瘤干细胞课题一课题二课题三课题四肿瘤早期发现课题五课题六肿瘤干预治疗不
2、典型增生原位癌细胞原发癌转移癌本项目的主要研究内容：本项目针对肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制关键科学问题，以筛选与肿瘤侵袭转移相关的新分子/标志物，开拓肿瘤早期预测、诊断和调控治疗的新方法为目标，展开以下研究：一、肿瘤发生/转移的分子基础研究（1）癌基因及抑癌基因的分子平衡研究：选择癌基因如OPN、ras、myc等与抑癌基因如HTPAP、p53、PTEN等，进行分子间信号转导网络平衡研究，了解这些基因突变、异常表达及产物的异常激活与细胞周期和肿瘤侵袭转移的关系；（2）转移相关分子的功能研究：以已建立的转移模型与细胞系为载体，结合生物信息学方法，建立系统而有效的方法对筛选到的肿瘤转移相关基
3、因进行鉴定。将利用基因克隆、RNA干扰、基因转染技术、基因敲除技术等结合免疫荧光显微术、流式细胞法、免疫沉淀和印迹、Transwell法、动物转移模型等手段，确定相关基因在肿瘤转移中的作用，发现关键的基因，阐述其作用机理，并评估其作为阻滞肿瘤转移的新药筛选靶标的价值；（3）转移相关分子的调控网络：应用模式生物、基因补偿、基因剔除、磷酸化、甲基化、糖基化、双荧光酶、双杂交及microRNA等技术，结合高通量技术及生物信息学技术探索转移相关分子调控网络；（4）肿瘤转移的分子干预：结合前一部分的基因/蛋白质组学研究发现，确立2-3个肝癌特异或可调控的具备功能的靶分子作为攻击目标（如OPN等），设计特
4、异性的siRNA、反义核酸、或小分子多肽等，以本项目组建立的肿瘤转移模型和转移细胞系进行验证。完成临床前研究。二、肿瘤发生发展过程与阻抑炎癌链的关键调控因子研究拟采用分子病毒学、肿瘤免疫学和肿瘤细胞生物学等研究手段，在基因水平、蛋白水平、网络调控、实验动物和临床标本等多个层面研究肿瘤发生/发展和“炎癌链”中的关键调控基因和蛋白。（1）探讨肿瘤免疫微环境对肿瘤转移的作用机制，明确炎癌链关键调控因子：研究乙型肝炎病毒x基因整合入肝细胞基因组与肝癌发生和转移的关系，揭示x基因在基因组中整合的规律，发现新的整合脆点，研究X蛋白的反式激活作用，探讨X蛋白与survivin蛋白的协同致癌作用，并阐述其分子
5、机制。深入探讨炎癌链的关键调控因子如补体调节蛋白（CRP）、NF-kB、免疫细胞和血小板等在肿瘤发生和转移中的作用，为临床早期诊断提供实验依据。（2）肿瘤干细胞介导发生/转移的分子机制研究：利用不同的表面标志（如CD133，CD90等），分离和鉴定获得肝癌等肿瘤组织与细胞系中的肿瘤干细胞亚群。检测肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞浸润能力的差异，建立相关的动物转移模型，检测不同细胞亚群的转移能力，明确特定肿瘤干细胞在转移中的作用。分别从基因组和转录水平系统比较肿瘤细胞、肿瘤干细胞（迁徙性肿瘤干细胞）与普通干细胞之间的差异，分析并筛选在迁徙性肿瘤干细胞中可能发挥作用的基因与蛋白。在以上研究基础上，重点选择
6、23个基因/蛋白进行研究，验证其在肿瘤发生与转移中的作用，明确其发挥作用的信号通路与分子调控机制，探索其作为肿瘤治疗靶标的可能性。三、肿瘤侵袭转移相关分子与信号转导通路研究（1）以本项目组开展的HAb18G/CD147、FAK、PI3K、Notch、NDRG2等关键信号分子的相互作用为切入点，利用免疫共定位、免疫共沉淀等分子生物学和蛋白组学的方法，研究肿瘤侵袭转移相关的信号通路构成及其相互串话（crosstalk）的关系；（2）肿瘤侵袭转移相关分子相互作用结构基础研究：利用生物大分子相互作用分析系统（Biacore）、蛋白分子核磁共振（NMR）或x-ray晶体衍射技术解析关键的肿瘤侵袭转移相关
7、分子空间结构，分析分子间相互作用可能的结构域，确定关键结合位点氨基酸残基。位点突变后确定其结合活性和细胞生物学功能；（3）肿瘤侵袭转移相关分子调控网络研究：根据以上分子的相互作用关系和结构生物学分析，结合细胞生物学功能鉴定，绘制多阶段、多层次的肿瘤侵袭转移相关分子调控网络，并由此发现和鉴定新的关键分子，为靶向干预肿瘤的侵袭转移过程提供新靶点。四、肿瘤发生/转移中细胞周期捕获、基质降解与血管生成研究（1）肿瘤细胞周期调控关键分子研究：以RNAi、单抗封闭及check-in过表达等技术研究肿瘤相关分子HAb18G/CD147等对肿瘤细胞周期的影响，并进一步鉴定其下游调控的细胞周期相关蛋白，明确其信
8、号转导通路；（2）研究细胞间信号分子（如CyPA）对肿瘤细胞周期功能的影响，并结合结构生物学和生物信息学预测结果，采用基因突变等方法，分析信号分子的相互作用关键残基位点；（3）筛选鉴定新型细胞周期调控相关的肿瘤转移关键分子，进行联合药物靶点细胞周期捕获研究；（4）鉴定CD146分子的天然配体，并系统研究其与CD146分子的相互作用机理及生物学功能，研究对CD146分子参与信号传导过程的逆向调控及抑制，丰富肿瘤血管生成机制的基础理论研究，为肿瘤血管靶向治疗提供新的思路。（5）将本课题组前期开发的KH903 VEGFR融合蛋白序列及其shRNA表达框架插入到已制备的AFP、hTERT和COX-2调
9、控的肿瘤裂解病毒，构建一种新型的抗新生血管生成的肝癌靶向性肿瘤裂解病毒，用于高效表达融合蛋白并有效抑制肿瘤组织的新生血管生成，同时能特异性地抑制VEGF/VEGFR的表达、并裂解肿瘤细胞，为临床肿瘤病人提供一条全新的肿瘤病毒基因治疗思路。五、肿瘤的早期预测与诊断在前期研究基础上，进行HAb18G/CD147、OPN、HTPAP等分子在乳腺癌、肝癌、肺癌的预警、早期诊断、检测定位、治疗反应、预后判断、复发监测等方面作为肿瘤标志物的临床评估，并探讨其机制。采用免疫组化及ELISA等方法，对不同分期的乳腺癌、肝癌、肺癌组织、癌前病变组织、正常组织及血清进行检测，分析其临床意义；并用分子原位杂交、微切
10、割、RT-PCR技术，确定各分子mRNA在组织中的表达，结合免疫组化结果进行分析及统计学处理，综合评估该分子在肿瘤早期预测、诊断中的临床应用价值，并申报国家诊断用新药证书。另外，进一步用MicroRNA分子标签预测肝癌复发、生存，并用已经获得的17个炎症免疫分子标签开展临床大样本研究，进行肝癌转移预测。六、抗肿瘤侵袭转移的调控阻抑治疗研究（1）通过筛选抗原性强、特异性高的肿瘤抗原，构建携带靶抗原（HAb18G/CD147等）的rAAV载体，感染肿瘤患者自身外周血单个核细胞来源DC，诱导DC活化产生靶抗原特异性CTL，开展临床免疫治疗，为晚期肿瘤患者提供一种更为有效的免疫治疗方法，以期提高生存率
11、，延长生存期。计划在3年内完成500-600例恶性肿瘤患者的临床研究，随访生存指标，全面评价rAAV-DC基因免疫治疗的疗效，并初步建立一套完整的DC临床免疫治疗疗效评价标准。（2）研究HAb18G/CD147分子参与肝纤维化发生机制：明确HAb18G/CD147分子表达和HSC活化的统计学相关性。在临床肝硬化、肝癌组织中进行验证。利用动物模型和细胞体系研究HAb18G/CD147分子对活化HSC的细胞生物学作用，包括细胞增殖周期、细胞迁移和收缩以及胞外基质蛋白分泌的影响，尤其考察该分子调控MMPs的分泌，从而揭示活化HSC对肿瘤细胞侵袭转移的作用。同时研究HAb18G/CD147在活化HSC
12、中表达的调控。（3）进行肝癌细胞和活化HSC的双靶向溶瘤病毒治疗基础研究：明确新城疫病毒（NDV）在肿瘤细胞和活化HSC中的选择性复制，阐述NDV在活化HSC中复制的信号通路；阐述NDV对肿瘤细胞和活化HSC的促凋亡作用以及NDV激活机体的抗肿瘤免疫反应机制；通过构建携带人源化anti-HAb18G/CD147 scFv的重组NDV，研究scFv通过封闭HAb18G/CD147分子而对肿瘤细胞和活化HSC的细胞生物学功能的影响。（4）构建HAb18G/CD147人源化抗体，并进行药效学试验及药理、毒理等安全性试验，完成临床前研究，申报临床批文，力争进入临床。二、预期目标总体目标：本项目围绕肿瘤
13、相关分子在癌进展中的多相调控机制，重点研究肿瘤发生发展过程中分子基础、免疫细胞/肿瘤干细胞介入、粘附因子和信号转导通路、血管生成与基质降解机制；获得原创性的与癌进展过程密切相关的分子/癌标志物；为肿瘤早期预测、诊断和调控阻抑治疗提供新策略、新方法；并建立和培养一支高水平的肿瘤生物学和肿瘤免疫学研究队伍。五年预期目标：1. 揭示恶性肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制，阐述肿瘤发生发展过程的分子平衡，建立自主创新的功能研究技术平台，为肿瘤早期发现和防治提供理论依据；2. 揭示调控肿瘤侵袭转移的关键因子及其功能，重点从细胞周期捕获、肿瘤新生血管形成等方面，阐述关键因子的表达调控及其对肿瘤细胞的生物
14、学功能，获得一批原创性成果；3. 阐述肿瘤侵袭转移相关分子相互作用的分子调控网络，建立关键分子的信号转导通路，从中筛选一批参与炎癌链发展和肿瘤侵袭转移的信号通路关键调节分子，获得自主知识产权的研究成果；4. 确定10-15个肿瘤转移相关基因，5-10个分子调控靶点，建立3-5种肿瘤发生/转移早期预测的分子体系，发展1-2个干预肿瘤发生/转移的拮抗剂；5. 研究成果主要以研究论文和独立研究的技术成果（专利）形式公布，获得国家发明专利或国际专利授权5-10项，发表高等级SCI论文50-60篇，其中影响因子10-20的5-10篇，5以上10-20篇，获省部级一等奖或国家高等级奖励2-3项；6. 培养
15、一批肿瘤生物学和肿瘤免疫学研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支结构合理、充满生机、与国际先进水平匹配的研究队伍。三、研究方案1、总体思路围绕细胞不典型增生原位癌原发癌转移癌的发生发展全过程，拟解决肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制关键科学问题。依据肿瘤细胞生物学的国际前沿科学问题，结合我们现有的研究基础来探索肿瘤侵袭转移的分子调控机制，充分发挥我们在肿瘤生物学和肿瘤免疫学方面的基础和临床优势，寻找和研究恶性肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制，获得原创性的与肿瘤侵袭转移等恶性行为密切相关的分子/癌标志物，为研制肿瘤早期检测盒和治疗剂提供新策略。以本项目组首次发现确定的具有自主知识产权的肿瘤侵袭转移关键分子HAb18G/CD147、癌基因OPN、抑癌基因HTPAP及肝癌转移预测模型等为基础，开展抗肿瘤侵袭转移的分子调控及肿瘤早期预测和诊断研究，展开联合攻关。各课题之间的关系见下图：癌基因和抑癌基因平衡失调关键科学问题肿瘤相关分子在癌进展中的多相调控机制早期发现阻抑治疗肿瘤调控分子网络课题六、抗肿瘤侵袭转移的调控阻抑治疗研究课题五、肿瘤的早期预测与诊断课题四、肿瘤细胞周期捕获与血管生成的分子基础研究课题三、肿瘤侵袭转移相关分子相互作用及调控研究课题二、肿瘤发生发展过程与阻抑炎癌链的关键调控因子研究课题一、肿瘤侵袭转移的分子平衡与表达调
