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1、第二章 病原生物的致病因子在适宜环境条件下，病原物对寄主植物致病能力大小取决于它们所具有致病因子多少和活性大小。病菌致病因子：酶、毒素、激素。近年来，人们试图利用生物工程和基因工程手段研制各种酶、毒素的抑制因子或进行病菌致病基因改良、抗病突变体筛选等工作，探索防病、治病新途径。目前，从许多病原细菌中克隆出来的hrp基因，是病原菌对寄主的致病性和诱导非寄主植物产生过敏性反应（HR）必须的基因，具有病菌与植物互作的核心功能。病原菌的致病因子的致病机理甚为复杂，首先要有对致病因子的性质的了解，才能考虑与寄主植物间的互作关系。所以必须建立在对病菌产生的酶、毒素、激素的本质及其作用机制的了解的基础上才能
2、有效、有目的的提供分子生物学、分子遗传学的研究理论依据。因此，本章将系统介绍病原物产生的酶、毒素、激素的主要种类及其在病程中的作用机理。第一节 酶病原菌侵入寄主植物表皮和细胞需要各种酶，其中最主要的是：角质酶和细胞壁降解酶（果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶、木质素降解酶和蛋白酶等）。一、角质酶植物体地上部分表皮的最外层是角质层，它主要是由直链的C16和C18羟基脂肪酸衍生出的难溶性多脂类化合物构成的角质组成。病原真菌直接侵入时用以突破这第一道屏障的酶就是角质酶。主要从病原真菌分离得到，表2-1列出检测到的7属12种真菌产生角质酶。表2-1 有角质酶活性的病原菌及其病害（7属12种）病菌寄主病害豌豆
3、根腐镰孢（Fusarium solani pisi）豌豆豌豆根腐病南瓜粉红镰孢（F. roseum sambucinum）南瓜南瓜赤霉病小麦黄色镰孢（F. roseum culmorum）小麦小麦赤霉病大麦根腐长蠕孢（Helminthosporium sativum）大麦大麦根腐病马铃薯疮痂菌（Streptomyces scabies）马铃薯马铃薯疮痂病盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）番木瓜番木瓜炭疽病辣椒刺盘孢（C. capsici）辣椒辣椒炭疽病禾生刺盘孢（C. graminicolum）玉米玉米炭疽病恶疫霉（Phytophthora cact
4、orum）苹果苹果疫病灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）苹果苹果灰霉病灰葡萄孢霉（B. cinerea）番茄番茄灰霉病苹果黑星菌（Venturia inequalis）苹果苹果黑星病（一）角质酶分子特性1、一般特性 酯酶 具同工酶（同工酶是指催化相同的化学反应,而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。），如F. solani pisi 有2个同工酶。 不同病菌角质酶氨基酸组成基本相同：均含有1个蛋氨酸（Met）、1个组氨酸（His）、1个色氨酸（Trp）； 分子量：2226kDa 角质酶：C端游离，N端不是游离（N端氨基酸通过酰胺键与葡萄糖醛酸连结，助于酶在胞外稳定
5、）2、催化特性 水解角质多聚体寡聚体单体 活性中心：三分体结构（三个基团）：丝氨酸残基上（羟基、羧基）和组氨酸（咪唑基） 实验设计：可通过抑制酶活性中心，来抑制酶的活性（二）角质酶在病菌直接侵入中的作用实验设计前提：已证实病菌可在离体下诱导产生角质酶。科研工作者从诱导或抑制角质酶的产生来证实病菌角质酶对寄主植物的作用。1、侵入位点的确定（实验设计）利用免疫技术和电镜观察：病菌孢子接种寄主；侵入后用角质酶抗血清处理侵入部位；电镜观察：侵入部位电子密集（抗原-抗体复合体：角质酶与抗血清结合）；证明角质酶存在。如利用茄腐皮镰孢豌豆专化型菌(Fusarium solani f.sp.pisi)和胶孢炭
6、疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)分别侵入豌豆和番木瓜的侵入位点都已发现了角质酶。2、钝化角质酶阻止病菌侵入实验设计：角质酶抗血清和酶抑制因子与病菌孢子悬液混合，病菌角质酶活性被钝化，说明病菌产生角质酶。例子：克瘟散、苯来特杀菌剂在离体条件下抑制角质酶活性，阻止病菌侵染。3、角质酶缺失突变株的产生实验设计：病原菌（用紫外线/化学药剂处理）角质酶缺失突变菌株（接种）表皮完整植株不发病 （接种）表皮损伤植株发病，产生病斑说明：病菌是依靠角质酶进行侵染的。4、角质酶缺失突变株致病力的恢复如果病菌是依靠角质酶侵染植物表皮的，那么在病菌角质酶缺失突变株中加入外源角质酶应
7、该能恢复其致病力。例子：F. solani pisi：T-8对豌豆完整/损伤茎表皮的致病力均高、萌发孢子产生角质酶多； 突变株：T-30仅对表皮损伤豌豆茎致病、产生角质酶少。 突变株T-30：+角质酶致病力不如T-8； +角质酶&纤维素酶、果胶酶、果胶甲脂酶与T-8致病力一致。说明：突变株T-30缺少一套完整的侵入酶系：角质酶、细胞壁降解酶。二、果胶降解酶（属于细胞壁降解酶类）（一）果胶酶（pectinase）的种类和一般特性果胶酶是一组复合酶，主要作用于果胶类物质，降解植物细胞壁果胶成分所引起的病害有软腐、干腐、枯萎、叶斑等。根据分解糖苷键反应性质分以下5种：1、果胶甲基酯酶（pectin
8、methylesterase，PME/PE） PME催化功能：将果胶或果胶酯酸的甲氧基脱掉产生胶酸； PME具同工酶：从灰葡萄孢（Botrytis cinerea）分离到PE、PE； PME能被金属离子激活：如Na+、Ca2+。2、果胶酸酯裂解酶（pectate lyase，PL）和果胶裂解酶（pectin lyase，PML）这两种酶均属裂解酶：能裂解果胶分子中连接半乳糖醛酸的-1，4糖苷键，称为反式消除酶（transeliminase），它作用于酸性多聚糖残基从而生成不饱和（C4、C5间形成不饱和键）的酸性寡糖。同时这两种酶易被二价阳离子激活，如Ca2+。3、多聚半乳糖醛酸酶（polyga
9、lacturonase，PG）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（pectin methyl-galacturonase，PMG）PG和PMG都是水解作用分解果胶物质-1，4糖苷键，释放出还原基团。两种酶均有同工酶。（二）果胶酶的致病作用1、果胶酶引起的病害症状（软腐、基腐、维管束枯萎等）软腐：被侵染的新鲜薄壁组织变软，呈水渍状，无色或变褐。 苹果灰星病菌（褐腐）：引起褐腐，PG降解寄主细胞壁的同时，病组织多酚氧化酶活性提高，寄主酚类物质被氧化成醌类物质而产生褐腐症状，接着酚类氧化产物又钝化病菌的PG，阻止细胞壁的进一步降解。 扩展青霉（白腐）：由于寄主多酚氧化酶的活性受抑。维管束病害：维管束纹孔膜板初生
10、细胞壁中胶层复合体被酶解后，释放凝胶堵塞导管造成枯萎；而酚类物质有时与凝胶交联，使维管束变褐。果胶酶能引起维管束枯萎，但并不意味果胶酶是导致枯萎的唯一因素，UV也可以引起维管束病害。2、专性寄生菌产生的细胞壁降解酶腐生和专性寄生菌降解寄主细胞壁的程度不同：一般专性寄生菌降解细胞壁程度较弱，因为专性寄生菌产生细胞壁降解酶的种类、数量、时间受到更为严格的控制，所以专性寄生菌侵染的寄主组织不能很快消解与崩溃。3、果胶酶引起的组织浸解和原生质体死亡组织浸解和原生质体死亡的酶学基础是揭示软腐病菌侵染机制的关键。 浸解作用：病原菌产生的果胶酶将粘连植物细胞间的果胶多糖物质降解，使寄主组织细胞彼此分离，组织
11、软化呈水渍状。 原生质体死亡原因： 果胶酶中有毒素； 果胶酶中含磷脂酶、蛋白酶、核糖核酸酶等，能使细胞死亡； 果胶酶除有酶活作用外，还有毒杀作用； 细胞壁经果胶酶分解后，细胞壁降解产物对细胞有毒； 细胞壁经果胶酶作用释放某些酶（主要是酚类氧化酶）及其酶解产物对原生质体有毒； 果胶酶可以和细胞膜或原生质体的糖醛酸起作用；渗透效应假说：细胞壁因胞间中胶层及多糖组分受果胶酶降解，使初生壁松弛，壁压下降，原生质膜在低渗中改变了弹性伸长结构，透性增大，随着质膜超过弹性极限而导致原生质体死亡。（三）果胶酶和其他因子的协同作用1、果胶酶与其他细胞壁降解酶的协同作用 病菌产生降解寄主细胞壁的酶有时间顺序：果胶
12、酶半纤维素酶纤维素酶如黄萎轮枝菌（Verticillium albo-atrum）侵染番茄茎部，其受降解酶降解的时间顺序：PG（多聚半乳糖醛酸酶）PGTE（PG反式消除酶）阿拉伯聚糖苷酶（半纤维素酶）木聚糖酶（半纤维素酶）Cx（纤维素酶）。所以细胞壁完全降解需要这些酶在时间上相互配合。 研究表明：细胞壁降解酶产生顺序与寄主细胞壁内各种多糖的分布有一定关系。一种果胶酶的作用可以促进另一种或一些细胞壁降解酶的作用。 细胞壁中的主要成份鼠李糖半乳糖苷部分降解，能促进其他酶对底物的降解作用。如endo PG（内切PG，随机作用于底物）和endo PGTE首先进攻植物细胞壁，松弛其结构，使细胞壁其他成分
13、暴露于其他降解酶作用之下，常称他们为“壁修饰酶”或“细胞壁改性酶”实验验证：桐叶槭离体细胞壁：真菌内切葡聚糖酶（纤维素酶）+endo PG释放1%壁多糖; 桐叶槭离体细胞壁：endo PG+内切葡聚糖酶释放10-15%多糖。2、果胶酶与蛋白酶的协同作用 蛋白酶可把细胞壁中蛋白质成分降解。 如瓜枝孢霉产生的蛋白酶与降解黄瓜下胚轴的果胶酶协同降解细胞壁。 endo PG+蛋白酶粗提液在30-60min内浸解组织； 果胶酶+纤维素酶需2-3h； 蛋白酶+纤维素酶在24h内未能浸解组织。 酶液处理桐叶槭细胞壁：蛋白酶处理：溶解细胞壁物质0.3%； endo PG处理细胞壁蛋白酶溶解物质达2%。3、果胶
14、酶活性与寄主组织酸度变化的关系病菌的一些代谢产物不仅本身对寄主有破坏作用，而且在浸解过程中与endo PG协同作用。如核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）侵染向日葵过程中，病菌代谢产物草酸促进了endo PG降解细胞壁，原因： 草酸螯合了寄主细胞内的钙离子，增强果胶物质的可溶性，使更易降解； 草酸降低了被侵染组织的pH，使寄主组织酸度更适合于果胶水解酶的活性。4、果胶酶活性与诱导寄主保卫反应的关系果胶酶不仅是病菌侵袭植物的手段，而且还能诱导寄主发生保卫反应。如：甘薯软腐病菌（Rhizopus stolonifer）的PG可诱导蓖麻幼苗产生蓖麻素； 核盘菌产生的PG和草酸能
15、激发大豆胚轴产生大豆素I。（四）果胶酶活性与病菌致病力的关系国内外学者对果胶酶与致病力的关系大致有三种观点：1、病原菌致病力与病原体外产生的果胶酶的能力相关。实验证据：Friedman & Ceponis用UV诱导马铃薯软腐病菌（E. carotovora）产生弱毒株系突变体，u 培养液（有毒株系）处理组织片段：32min后组织崩解；u 培养液（无毒株系）处理组织：需要72min。u 有毒株系培养液处理的组织内累积的半乳糖醛酸单体是弱毒株系的4.5倍，说明有毒株系的培养液具有较强断裂果胶链的活性。2、活体外产生的果胶酶能力与病菌致病力无关如P. aphanidermatum侵染的黄瓜腐烂组织中分离的果胶酶才能使黄瓜组织软化。只有在活体条件下，病菌的细胞壁降解酶（果胶酶为主）综合作用与病
