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1、急性毒性及其评价方法,Acute Toxicity Testing,一、急性毒性的概念,急性毒性：是指机体(人或实验动物)一次或24小时内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应。 包括外观改变、大体形态变化、行为方式及死亡效应，最主要观察指标是LD50,实验动物接触化学物的方式或途径不同， “一次”的含义也有所不同 经口和注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内 经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次” 是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程,二 、急性毒性试验的目的,1. 测试和求出受试化学物的致死剂量 (通常以LD 50 为主要参数)，并对该外源化学物进行
2、急性毒性分级 2. 通过观察动物中毒作用表现、毒作用强 度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量反应关系和对人体产生损害的危险性,3. 为亚慢性及慢性毒性试验研究以及其他 毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据 4. 为毒作用机理研究提供线索，了解中毒 效应的特征（包括症状，生理、生化与组织病理损伤） 5. 研究化学物急性中毒诊断、预防和急救 治疗措施,三、急性毒性试验方法的要点,(一) 实验动物选择 选择实验动物的原则： 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物 易于饲养，试验动物操作方便 繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应 价格较低，易于获得动物 常用实验动物为大白鼠和小白
3、鼠,性别, 急性毒性试验所用的动物应当是雌、雄各半 如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性动物各自的LD 50 值 如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做雌性动物的LD 50 试验,实验动物分组和数量,在利用不同的方法测定化学物LD 50 时，实验设计中对动物数的要求不同 霍恩氏法测 LD 50 时要求有 4个剂量组， 每组4或 5只动物 改进寇氏法、概率单位法、Bliss法测定则要求57个 剂量组，每组10只动物或10只以上 对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量,动物分组的原则：均衡性和随机性,均衡性：要求各组动物的平均体重
4、及体重的离散度尽可能一致。具体来说是： （1）实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的10-控制离散度 （2）每组之间的平均体重相差不应超过 5 -控制均衡性 随机性：每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见或系统误差,实验动物的预处理,适应性饲养一周，选择生理健康的动物 凡经口染毒时，要求试验前要对动物禁食，以保证胃内无食物，减少食物对化学物毒性的干扰 大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h 大动物每日上午喂食前染毒 染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水,(二) 受试物及处理,受试物的接受、分样、保管、称重、配制 以及在此过程中严格的质量保证影响急性 毒性试验 受试物剂型：水溶液
5、、混悬液、油溶液,(三) 染毒方法,1. 经口(胃肠道)染毒： （1）灌胃： 空腹 灌胃后2-3 h复食 灌胃的体积不超过体重的1-2： 小鼠为 0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g较合适 大鼠为5ml/只(通常用0.51.0ml/100g） 家兔为10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg,灌胃器具制作,取l2号普通注射针头，首先将针头尖部去掉，然后用细锉刀把去掉部分锉平、锉光，再用沙纸磨光滑，有条件时可在针尖处点焊成球型。加工成有20度弧度的灌胃针，连接1ml或5ml的注射器，即成为大小鼠的灌胃器。,灌胃操作方法,先固定动物,即用右手将小鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙的平面上，
6、当小鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住小鼠尾巴即可。在固定小鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。 以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。,2. 经呼吸道接触,在常温、常压下为气态，或在生产过程中 和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘 状态污染生产与生活环境空气，此时就有 可能经呼吸道吸入。 吸入接触分为两种方式 ： 静式吸入 动式吸入,3. 经皮肤染毒, 研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和
7、豚鼠 但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性 (求经皮LD 50 )所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替,4. 经注射染毒,(四) 试验程序,1、查阅文献 首先了解分析受试化学物的化学结构和其理化性质，依此查阅文献， 找出与受试化学物化学结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。,2、预试验, 以此预期毒性中值为待测化学物的中间剂量组，再上下各推12个剂量组做预试验（每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化学物的致死剂量范围） 根据确定的剂量组进行染毒 根据预试验的死亡资料确定
8、组距 可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。,3、正式试验,一般来说，根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如改良寇氏法一般设57个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i后，以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i ,
9、4. 症状观察,(1) 观察时间和周期 测定外源化学物的LD 50 (LC 50 )，一般要 求计算实验动物接触化学物之后两周 （14天）内的总死亡数 对于一些速死性化学物求其LD 50 (LC 50 ) 也可仅计算24小时的死亡率（有些速杀性化学物的24小时LD 50 与两周 LD 50 值往往没有差别 ） 应注明是多少时间的LD 50 值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础,（2） 中毒体症和发生过程观察,很多化学物在实验动物接触的初期往往先出现兴奋现象，有的化学物在动物接触的初期首先表现为抑制现象,（3）死亡情况和时间分布：计算LD 50,重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现
10、死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。,（4）体重：,体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻；若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物，应在观察期14天内称量其体重的变化，以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,（5）病理检查和其它指标观察,凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查 对存活动物于观察期结束后应做病理学检查 根据试验需要可进行某些生化指标测定等,经典急性毒性试验的局限性,消耗的动物量大 获得的信息有限 测得的LD50是一个统计近似值 在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,急性毒性替代试验,固定剂量法 上下移动法,四、急性毒性分级和评价,
